[发明专利]一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法

说明书

 

技术领域

     本发明涉及细胞色素P450酶，特别涉及一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法。

背景技术

细胞色素P450（CYP450）酶是内质网膜上混合功能氧化酶系统的末端氧化酶，是I相反应中活性最强的代谢酶，可参与许多前致癌物和前毒素的代谢活化，生成亲电性很强的中间产物或终产物，引发一系列的毒性效应。现有研究CYP450酶代谢活化外源化合物的途径主要分体内和体外代谢两种。体内代谢研究以动物模型为代表，但不同种属的动物与人之间存在较大的差异，尤其是在代谢方面，参与化合物代谢的酶种类、酶的贡献程度、反应类型以及代谢产物等均可能不相同，把动物实验结果外推到人体误差高且准确性低。此外，CYP酶的代谢底物非常广泛，每个CYP 酶都有其特异的代谢谱，开展单种代谢酶对毒物的代谢特征研究就需要得到单一组分的CYP酶，动物体内代谢中参与化合物代谢的酶种类繁多，难以达到目的。随着对CYP酶的深入认识，人们开始通过各种方法得到单一的纯酶，构建各种体外代谢系统，对外源化合物的体外代谢进行研究。最初，人们通过纯化哺乳动物肝或肾中的CYPs 得到单一的纯酶再进行研究，但CYPs 家族中的各种代谢酶的性质非常接近，很难得到纯酶，或者产量很低。到了20 世纪90 年代，随着分子生物学、生物化学的飞速发展，通过在异源表达系统中表达得到纯CYPs酶已成为得到单一纯酶并进而开展化学物体外代谢的主要方法手段。

到目前为止，几个常用的表达体系，如细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等系统都已被用于CYP450s 的表达。其中杆状病毒昆虫细胞（Baculovirus/Sf9）表达系统可高效表达外源基因，且昆虫细胞的蛋白加工和修饰方式与哺乳动物细胞相似，可实现较为正确的蛋白糖基化、分泌和组织定位表达，且蛋白表达量高，可以高水平表达多种原始的CYP450蛋白。但CYP450蛋白的异源表达除了需要有完整的细胞、亚细胞结构、正确的蛋白糖基化、分泌和组织定位表达外，还需要有血红素等辅助因子的参与，同时CYP450酶活性的发挥还需要细胞色素P450氧化还原酶（POR）、NADPH等辅酶为其提供电子，所以如何在各种异源表达系统中得到高量、有酶活性的CYP450蛋白成为了化合物体外代谢的关键点和难点。

如前所述，CYP450s酶类需要在血红素铁上加入两个电子（即被还原后）才能行使其活性，这种电子一般由与CYP450短暂结合的蛋白作为电子供体，从辅基中传递而提供。哺乳动物CYP450s作为膜结合蛋白质，有些位于线粒体内膜，有些位于内质网，共有两条不同的电子传递链，CYP450s的位置不同电子传递链也不同，在内质网中为CYP450提供电子的蛋白是POR蛋白。人的POR蛋白是一种膜结合的黄素蛋白，它由相同比例的FMN和FAD黄素蛋白组成，存在于大多数真核细胞中，是一些内质网结合的加氧酶蛋白的电子供体蛋白，它可以从NADPH为CYP450s提供电子。

为系统研究CYP450 对化合物的代谢活化作用，提高体外代谢反应效率，因此研究CYP450和POR非常有必要。但采用经典方法制备CYP450和POR的时，发现其得率很低，难以满足研究需求。本发明提供一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法，使得CYP450和POR能高效表达且活性较高。

 

发明内容

发明目的：本发明的目的在于：本发明提供一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法，使得CYP450和POR能高效表达且活性较高。

技术方案

一种改进细胞色素P450酶家族体外表达的方法，其特征在于在步骤4所述的有关辅助因子的4种条件之一：①0.5-6μg/ml Hemin；②0.05-0.6mM 5-ALA；③0.01-0.4mM Fe³⁺；④0.05-0.6mM -ALA 和0.01-0.4mM Fe³⁺混合物。最优化的条件为0.2 mM 5-ALA与0.02mM Fe³⁺混合物。

具体制备方法如下（以CYP2A13和POR为例）：

1、重组转移载体pFastBac1-CYPs/POR质粒的构建与鉴定