[发明专利]检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条，本发明还涉及一种采用该胶体金免疫试纸条检测李痘病毒的方法。

背景技术

李痘病毒(Plumpoxvirus，PPV)是我国颁布的最新检疫性病原物，属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)中的马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，它是核果类果树危险性最大的病毒之一(Dunez，Sutic，1988；Nemeth，1994)，其自然寄主主要是李属的木本植物，如杏(PrunusarmeniacaL.)、桃(P.persicaL.)和欧洲及日本的李子(P.domesticaL.和P.salicinaLindl.)以及甜樱桃(P.aviumL.)和酸樱1桃(P.cerasusL.)等。果树一旦受其侵染，则叶片扭曲褪绿，叶脉黄化，特别是果实变形变小，出现花斑，造成品质下降，未成熟果实大量脱落，使产量严重降低，而且其传播速度快，在短时间内即可能给果树业的发展带来灾难性损失。

广东地处我国的南方开放地区，地理环境优越，每年经过广东辖区口岸的进出境种子，花卉，苗木等容易携带病毒的材料约占我国总数量的一半，由于进出境批次多，数量庞大，急需研究出即能保证一定的检测数量，又能够检测速度快，而且灵敏度要高，成本也不太昂贵的检测方法。虽然目前在口岸对果树病毒病检测仍然以酶联免疫吸附法(ELISA)为主，但是ELISA需要专门的仪器设备，而且需要有专业人员才可以进行检测判定，操作繁琐，所需时间也比较长，急需更为简单快速灵敏的检测方法才能更加适合口岸快检快放的要求。

目前国外国内，植物病毒的检测方法主要有如下5种：一是传统的生物学方法，其特点是周期长，准确度低，检测病毒数量少，劳动强度大，；二是电子显微镜方法，但它只能观察病毒粒体形态，不能鉴定病毒种类，而且操作复杂，价格十分昂贵；三是酶联免疫吸附分析法，是目前应用最广的病毒检测方法，但其检测时间长，操作步骤多，而且需要专用仪器和购买昂贵的特异性抗血清；四是PCR方法虽然灵敏度非常高且快速，但更需要专用仪器和专业人员，而且检测通量有限；五是基因芯片检测技术，它是目前最有发展前途和潜力的检测方法，但其检测结果的稳定性和重复性还有必要进一步完善，而且仪器价格也是十分昂贵，操作复杂，检测时间也长。

因此，非常有必要在上述5种方法之外再研究新的检测方法，以便充分满足一线口岸植物种苗病毒快速检测的需要。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种使用方便，能快速检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条。

本发明另一个目的是提供一种采用该胶体金免疫试纸条检测李痘病毒的方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下方案：

一种检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于按以下步骤制备：

A、从李痘病毒感病材料中提取李痘病毒的RNA；

B、用RT-PCR的方法克隆李痘病毒的外壳蛋白基因，然后将其连接到原核表达载体pET29(a)上，得到pET29a-PPV重组载体，以序列测定最终验证阅读框架正确的重组质粒，用以李痘病毒外壳蛋白基因的诱导表达；将pET29a-PPV重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)；

C、用亲和柱法回收特异性表达蛋白，再免疫家兔，获得李痘病毒抗血清；

D、采用上述抗血清制备出检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条。

如上所述的检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于步骤A中从李痘病毒感病材料中提取李痘病毒的RNA具体包括以下步骤：

(1)李痘病毒感病材料的幼嫩组织若干，液氮研磨，分装成＜100mg小份至预冷E.P.管，100mg样品加入1mLTriZOL抽提；

(2)12000rpm，2-8℃离心10min；

(3)吸取上清液，转移至新的1.5mLE.P.管中，15-30℃放置5min；

(4)加0.2mL氯仿，充分抽提8min，15-30℃放置2-3min；

(5)12000rpm、2-8℃离心15min；

(6)吸取上清液，转移至新的1.5mLE.P.管中，加0.5mL异丙醇，15-30℃放置10min；

(7)12000rpm、2-8℃离心10min；

(8)弃去上清液，得胶体状RNA，加1-1.5mL75％乙醇，涡旋混匀；

(9)7500rpm、2-8℃离心5min，弃去上清，留下胶体状RNA；

(10)干燥5-10min；