[发明专利]一种用于核酸实时检测的探针及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子检测领域，特别涉及一种用于核酸实时荧光检测的新型探针。本发明还涉及到“品形”探针的技术应用。

背景技术

聚合酶链反应（PCR）技术是一种简单快捷、高灵敏、特异的基因扩增方法，其过程通常包括20-50个由变性、退火和延伸三步反应构成的循环。可以在1.5-3小时内特异地扩增靶核酸序列至几百万倍。近年来，由于实时PCR仪的出现使普通PCR不再需要凝胶电泳分析，从而不必PCR后操作，杜绝了PCR污染。因此实时PCR技术在临床上应用越来越广泛。

实时荧光定量PCR检测技术最早使用荧光染料，例如SYBR GREEN，EVE-GREEN，以指示PCR反应。随后，实时荧光PCR检测技术中开始应用标记荧光的核酸探针，例如5`-核酸外切酶技术中使用的Taqman探针、分子信标、荧光能量转移探针(相邻探针)、蝎子引物、点亮探针等。染料法尽管简单，然而其无法识别非特异扩增，尤其是由于引物二聚体引起的非特异性扩增，因此在实际应用中受到很大限制。探针法对扩增产物具有第二识别步骤，从而避免了非特异扩增，结果更加可靠。不过，如前所述的探针普遍存在设计复杂，荧光本底高，对单碱基突变识别能力有限等不足。

发明内容

本发明所要解决的首要技术问题是提供一种对核酸实时检测的探针，该探针在设计思路上与前述的当前探针根本不同。此探针设计简单、易于合成、荧光本底低。本发明的“品形”探针检测技术是基于对靶核酸的直接杂交，该探针由于5`端和3`端都具有与探针内部互补的序列，可以形成3段双链和2个环形结构，5`端的荧光基团或荧光供体与3`端的淬灭基团或荧光受体能充分靠近、荧光淬灭充分，所以在PCR退火时荧光本底低，而两个环形结构也很容易打开，因此对靶序列的杂交效率高。

本发明所要解决的另外一个技术问题是提供上述探针的应用。

本发明解决上述首要技术问题所采用的技术方案为：一种用于核酸实时检测的探针，其特征在于：探针是一条寡核苷酸，包括十个部分区域，3`端的第一区域与5`端的第八区域形成第一段双链，使得5`端连接的荧光基团或荧光供体与3`端连接的淬灭基团或荧光受体靠近，从而无荧光发出；第二区域和第四区域配对、第五区域和第七区域配对，构成另外2段双链；而第三区域和第六区域分别形成两个环形结构；并使探针的第三区、第四区、第五区、第六区的碱基与靶序列互补，形成靶序列结合区。

作为优选，所述的位于3`端和5`端第一段双链结合区的长度为5-20bp。

作为优选，所述的位于3`端与所述的靶序列结合区中一段序列互补双链结合区的长度为3-10bp。也就是第二区域和第四区域配对一段双链的长度是3-10bp。

作为优选，所述的位于5`端与所述的靶序列结合区中一段序列互补双链结合区的长度为3-10bp。也就是第五区域和第七区域配对一段双链的长度是3-10bp。

作为优选，靠近所述的靶序列结合区3`端的3`端环形结构的长度为3-15bp。也就是第三区域的单链环形结构的长度是3-15bp。

作为优选，靠近所述的靶序列结合区5`端的5`端环形结构的长度为3-15bp。也就是第六区域的单链环形结构的长度是3-15bp。

作为优选，所述的探针总长度为20-100bp，其中靶序列结合区10-50bp。

优选，所述的探针为DNA或RNA。

再改进，所述的靶序列结合区中，可以引入至少一个或不引入非自然的核苷。

作为改进，所述的第一段双链在中心线位置，而第二区域和第四区域配对双链和第五区域和第七区域配对双链接着分布在第一段双链的两侧，第三区域的环形结构在第二区域和第四区域配对双链之间，第六区域的环形结构在第五区域和第七区域配对双链之间。最后构成大体品字形探针。

最后，所述的探针内部双链结合区域Tm值与扩增引物Tm值相当或高于退火温度2-12℃。

本发明解决另外一个技术问题所采用的技术方案为：一种上述的用于核酸实时检测的探针，其特征在于在靶序列实时PCR检测方法上应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

设计简单：品形探针时没有太多要求，探针序列为扩增靶序列的一部分，只要探针的双链结合区的Tm值与相应的PCR反应体系中的引物或使用的退火温度保持一致或高出。任何设计过PCR引物的人员都可以设计。

荧光本底低：荧光报告基团和淬灭基团非常靠近，淬灭效果理想。