[发明专利]一种TMEM16A钙激活氯离子通道抑制剂的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种TMEM16A钙激活氯离子通道抑制剂的筛选方法。

背景技术

钙激活氯离子通道（Calcium-activated Chloride Channels,CaCCs）由于被细胞内部钙离子所激活而得名，最早发现于非洲爪蟾卵母细胞中，随后相继有报道表明上皮细胞、血管内皮细胞、神经元、平滑肌与心肌细胞中都存在。钙离子介导的信号转导途径是真核生物信号转导的重要组成部分，因此CaCCs执行多种功能，包括卵细胞的受精、跨上皮离子/液体转运、心肌细胞复极化和动作电位发生、嗅觉传导及平滑肌伸缩的调节等。

由于技术的原因，CaCCs的分子基础问题一直未能解决，导致相关药理学研究进程极为缓慢。直到2008年底，有三个研究小组独立报道CaCCs的分子基础是跨膜蛋白16A（transmembrane16A,简称TMEM16A）（Schroeder BC等，Cell,2008,134:1019-1029;Caputo A等，Science,2008,322:590-594;Yang YD等，Nature,2008,455:1210-1215）。这一发现为在特定细胞和组织中研究CaCCs的生理学和药理学等方面的问题提供了新的研究平台。

最近发现TMEM16A通道与多种重大疾病密切相关。文献报道，TMEM16A离子通道可能是肺囊性纤维化（CF）疾病的药物靶点，激活TMEM16A通道可起到补偿上皮组织上氯离子通道囊性纤维化跨膜传导调节蛋白（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，简称CFTR）基因突变所致的离子/液体转运不平衡（Rock JR等，J.Biol.Chem.,2009,284:14875-14880）。另外，2012年，Wang等（Wang M等，Circulation，2012,125:697-707）证明TMEM16A是脑血管平滑肌细胞CaCCs的分子基础，并且发现TMEM16A离子通道的活性与血压呈负相关。另一方面，CaCCs的抑制剂被报道可用于治疗哮喘、胃肠动力学障碍疾病和某些类型的肿瘤等。由此可见，筛选TMEM16A离子通道特异性调节剂可为CaCCs相关疾病的治疗提供新的药物靶点。

美国生命科学技术公司Invitrogen^TM的试剂盒Premo^TM卤化物传感器运用黄色荧光蛋白（Yellow Fluorescence Protein,YFP）的三突变体蛋白质YFP-F46L/H148Q/I152L的荧光作为指标，筛选CaCCs/TMEM16A离子通道的调节剂。运用此方法，2010年，Namkung等（Namkung W等，The FASEB J.,2010,24:4178-4186）应用Premo^TM卤化物传感器试剂盒筛选得到单宁酸（tannic acid）及相关的没食子单宁（gallotannin）为TMEM16A/CaCCs的抑制剂。

遗憾的是，目前缺乏简便易行的TMEM16A钙激活氯离子通道抑制剂的筛选方法，导致以TMEM16A/CaCCs为药物靶点的高血压、CF病、哮喘、胃肠动力学障碍和某些类型的肿瘤等疾病中的应用研究发展缓慢。

发明内容

本发明的目的是提供一种TMEM16A钙激活氯离子通道抑制剂的筛选方法，通过该筛选方法筛选出的TMEM16A钙激活氯离子通道抑制剂为研究TMEM16A/CaCCs在高血压、CF病、哮喘、胃肠动力学障碍疾病和某些类型的肿瘤等疾病中的应用提供基础。

本发明提供了一种TMEM16A钙激活氯离子通道抑制剂的筛选方法,使用TMEM16A钙激活氯离子通道激活剂壳寡糖作为筛选抑制剂的阳性对照物，包括如下步骤：

（a）将TMEM16A质粒稳定转染入哺乳动物细胞HEK293细胞；

（b）将黄色荧光蛋白YFP三突变体YFP-F46L/H148Q/I152L导入步骤（a）中的稳定转染TMEM16A钙激活氯离子通道的HEK293细胞；

（c）将候选药物与步骤（b）所述导入后的细胞孵育，再加入含有碘离子的溶液观察，发现荧光强度无变化，此时再加入壳寡糖荧光强度仍无变化，则确定候选药物可能为TMEM16A通道的抑制剂，并采用步骤（d）进行进一步验证；