[发明专利]一种大量繁育同源纯合四倍体铁皮石斛的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种铁皮石斛新品种培育方法，尤其是一种大量繁育同源四倍体铁皮石斛的方法，属于生物技术育种领域。

背景技术

铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是传统名贵珍稀中药材，具有益胃生津、滋阴清热、增强免疫力、消除肿瘤、抑制癌症等独特的功效。1000多年前的《道藏》将铁皮石斛列为“中华九大仙草之首”，其在民间也素有“救命仙草”之称，国际药用植物界将之誉为“药界大熊猫”。虽其功效独特但目前野生资源已濒临枯竭，加之人工种植投入高，且现有二倍体石斛种质难以保证、生长缓慢，成活率低下，造成人工种植铁皮石斛的产量低，品质参次不齐，农户种植积极性低下，国内市场供需矛盾日益突出，而现代多倍体育种技术为繁育出高产、抗逆性强，药用成份高的优质铁皮石斛提供了可能，通过多倍体育种技术可大大提升铁皮石斛的种植积极性，促进我国石斛产业的发展。

经对现有技术文献检索发现铁皮石斛四倍体研究鲜有报道，仅发现专利200710061225.8报道了铁皮石斛四倍体的培育方法，虽此法诱变率较高但存在一定的缺陷：a、以石斛种子为出发点，受季节气候影响有一定的局限性。b、育种周期长，从授粉、播种、诱变、种植、培育、育种到产业化应用需五年以上的时间。c、四倍体植株中嵌合四倍体的频率较高，种质难以保证d、一次仅可获得百株四倍体植株，仅适用于实验室研究阶段，难以满足实际产业化生产需求，需进一步改进。

发明内容

针对传统方法的不足，本发明提供了一种大量繁育同源纯合四倍体铁皮石斛的方法，本方法简单有效易行，缩短了传统四倍体育种时间，大大提高传统四倍体育种的纯合性和培育产量。

为实现以上目的，本发明提供了如下技术方案：一种大量繁育同源纯合四倍体铁皮石斛的方法，其特征在于包括以下步骤：选用石斛组培续代1~4代过程中产生的黄绿色且没有茎尖分化的原球茎，用秋水仙素进行四倍体诱变，处理后转入原球茎分化培养基中培养出再生植株，按常规方式进行栽培管理，对再生植株的根尖染色体进行检测，筛选出纯合四倍体植株，切取具有优良性状的纯合四倍体植株的茎段，转接入原球茎诱导培养基中，续代三次后将原球茎进行诱导分化出再生四倍体植株。

优选，所述的四倍体诱变处理为，在含0.04~0.06wt%秋水仙碱的1/3~1/2MS（MS基本培养基的中大量元素浓度减为1/3~1/2）液体培养基中诱变处理60~72h，优选是含0.05wt%秋水仙碱的1/3~1/2MS液体培养基。

优选，所述的原球茎分化培养基为：萘乙酸（NAA）0.5~1.5mg/L+花宝1号0.4~1.0g/L+蔗糖2-4wt%+香蕉10~15wt%的1/3~1/2MS固体培养基。

作为改进，所述的切取具有优良性状的纯合四倍体植株茎段，其切方法为从相连的两个茎节节点处斜切茎段，将带有两个斜切口的茎段水平接种于原球茎诱导培养基，每个母瓶中接种一个茎段。

优选，所述的原球茎诱导培养基的组成为1/3~1/2MS+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.2~0.5mg/L+NAA0.3~0.6mg/L+活性炭0.5~1.5g/L

与现有技术相比，本发明的优点在于：采用石斛组培过程中产生的原球茎为材料进行四倍体诱变，不受季节气候的影响，对根尖染色体镜检后用流式细胞仪筛选出纯合四倍体植株，将性状优良的四倍体植株的茎段转接愈伤组织诱导培养基中，经续代、分化一次性即可获得数万株优质纯合同源四倍体铁皮石斛种苗，本方法简单有效易行，缩短了传统四倍体育种时间，大大提高传统四倍体育种的纯合性，可以大量繁育同源纯合四倍体铁皮石斛，提高了铁皮石斛的品质和产量。

附图说明

图1是黄绿色原球茎照片；

图2是四倍体植株照片；

图3是二倍体2n=38染色体的照片；

图4是四倍体染色体2n=76的照片；

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

一种大量繁育同源纯合四倍体铁皮石斛的方法，包括以下步骤：

1）选取原球茎：选取在石斛组培续代1~4代过程中产生的原球茎，要求选取黄绿色且没有原球茎尖分化的原球茎。

2）四倍体诱变处理：无菌条件下将选取的原球茎转入含有0.05%秋水仙碱的1/3~1/2MS液体培养基中进行诱变处理60~72h。