[发明专利]纤维蛋白胶复合人重组骨形态发生蛋白2微球的制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明专利属于医用材料，主要通过局部注射应用，减少手术创伤，并不断补充局部骨形态发生蛋白2来促进成骨，加速骨折及骨不连的愈合过程。 

背景技术

骨折愈合是一个极其复杂的骨组织再生修复过程，许多因素可以影响骨折愈合，导致骨折延迟愈合或不愈合(骨不连)。科研人员以及临床医师一直致力于研究促进骨折愈合和减少骨折延迟愈合或不愈合的治疗方法。 

1965年，美国医生Urist(Urist MR.Bone：formation byautoinduction.Science，1965，150(698)：893-899)发现脱钙的骨间质有异位成骨作用，将新发现的具有诱导新骨形成的蛋白质命名为骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic protein，BMP)。随后，又发现了众多的BMP，除了BMP-1，它们都是TGF-beta超家族成员，无论在基因或者蛋白质结构上，还是在生物学功能上都非常相似。其中BMP-2的成骨作用研究的最多，产业化研究也最为广泛。天然的BMP-2在各种组织中的含量极低，需要采用基因重组的方法进行大量生产。 

大量的实验研究和临床实践证明：重组人骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)等外源性生长因子在治疗骨不愈合、骨延迟愈合、骨缺损及脊柱融合过程中，其骨连接的速度和质量不仅优于单纯自体骨移植，而且能使那些自体骨移植失败的骨不连得以愈合。然而活性生长因子在体内的半衰期短，全身和局部应用很快被稀释代谢，达不到所期望的生物效应。 

聚乳酸一聚乙二醇共聚物(PLA-PEG，PLGA)不但具有生物相容性好、无免疫反应等特点，而且可通过调节聚乳酸和聚乙醇酸二单体的比例得到不同降解速率的载体材料，因而重组人骨形态发生蛋白2/聚乳酸-聚乙醇酸共聚物rhBMP-2/PLGA微球可以用作药物载体材料。尽管微球在药物缓释方面取得了可喜的成果。但在临床操作中，常存在着以下的问题：采用生理盐水溶解时，活性成分易于吸收、流失，不能在局部维持较高浓度；而采用静脉血或骨髓血溶解时凝固时间难以掌握，往往在体外已凝血，失去可注射性，操作不便，因此还需一种能控制凝固时间的缓释载体。纤维蛋白胶作为粘合剂已在外科临床得到广泛应用，是利用纤维蛋白原和凝血酶的反应制成具有强大粘合力的纤维蛋白胶凝块，可在体内快速成型，避免了骨诱导因子的流失问题，并具有抗原性低，降解性好，促进血管化和骨传导等多种特性和生理功能，可以作为微球的复合材料。 

发明内容

本发明专利针对骨形态发生蛋白2临床应用中的不足，构建具有很好降解性和成骨活性的rhBMP-2/PLGA微球/纤维蛋白胶复合材料。 

技术方案 

本发明专利的目的通过以下技术方案来实现： 

采用复乳-溶剂挥发法制备rhBMP-2/PLGA载药微球，对影响微球成球性及粒径的主要因素进行探讨，制备出粒径适宜的缓释微球。 

rhBMP-2干粉用盐酸胍溶液溶解，过滤，然后得到的盐酸胍溶液稀释到磷酸盐缓冲液中形成溶液，并加入牛血清白蛋白做保护剂，混匀，形成内水相。 

PLGA微球溶于二氯甲烷中形成油相， 

内水相加入油相中冰浴超声乳化，形成初乳， 

将初乳加入到外水相中， 

搅拌挥尽溶剂，过滤，蒸馏水洗涤，真空冻干，储存。 

并对微球的理化特性进行研究。然后构建rhBMP-2/PLGA微球/纤维蛋白胶复合材料，观察其微观结构，分析其化学构成，检测材料溶解特性及rhBMP-2与材料复合后的释放规律，探讨rhBMP-2/PLGA微球/纤维蛋白胶临床实际应用的可行性。 

rhBMP-2来自于：解放军军事医学科学院(赵明，王会信，周廷冲.重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽在大肠杆菌中的表达及其诱导成骨活性，生物化学杂志，1994，10(3)：319-324). 

PLGA来自于：PLA/PGA 75/25，MW＝3000，山东省医疗器械研究所 

纤维蛋白胶来自于：杭州普济公司 

技术方案的具体工艺步骤采用复乳-溶剂挥发法制备： 

rhBMP-2干粉10mg用4M盐酸胍溶液0.5ml溶解，过滤，然后得到的盐酸胍溶液稀释到10mM的pbs磷酸盐缓冲液中形成约为10mg/ml的溶液。并加入1％的牛血清白蛋白1mg做保护剂，混匀，形成内水相。 

100mg的PLGA溶于0.7ml含2.5％司盘-20的二氯甲烷中形成油相，