[发明专利]用于检测人类EGFR基因突变的引物、探针、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于基因突变检测技术老年领域，特别涉及检测人类EGFR基因29种突变的引物、探针、试剂盒及检测方法。

背景技术

人类表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）是一种蛋白酪氨酸激酶受体，广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，具有酪氨酸激酶活性。它是HER/ErbB家族成员之一，因此又名HER1或ErbB1。EGFR与其配体结合后在细胞表面形成二聚体，通过酪氨酸激酶的活性，激活受体自磷酸化，在细胞内发出信号，经过细胞质中衔接蛋白和酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化和凋亡。当EGFR发生突变时，EGFR自身或其配体过表达，从而通过自分泌或旁分泌方式刺激细胞形成失控性增殖。此外，EGFR过度活化还可以启动多种蛋白水解酶和促血管生成因子的表达，从而加速癌细胞的转移。因此，EGFR过表达者通常预后较差。

美国食品药品监督管理局于2003年5月批准了美国阿斯利康（Aotrazeneca）公司生产的小分子基因靶点药物吉非替尼（Gefitinib，也称为易瑞沙/Iressa）用于治疗晚期非小细胞肺癌（NSCLC），我国也与2005年2月批准了吉非替尼进入临床。吉非替尼是一种口服的小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI），它可以特异性地竞争结合癌细胞EGFR激酶功能区的ATP结合位点，通过抑制该酶的活性来抑制肿瘤的增长、增殖，却无明显的化疗副作用。美国哈佛医学院的研究人员Lynch等率先报道，肺癌细胞中有EGFR酪氨酸激酶基因编码区18~21外显子突变的患者，靶向药物吉非替尼的有效率高达80％以上。这种现象可能是由于EGFR突变使EGFR酪氨酸激酶ATP结合位点的某些基团发生重构，增强了与ATP或其竞争性抑制剂吉非替尼的相互作用。因此，有EGFR基因突变的患者表现出对吉非替尼更好的治疗反应。研究表明，美国非小细胞肺癌患者中只有约10%有EGFR基因突变，然而在亚洲人中，约30%的非小细胞肺癌患者有EGFR基因突变。临床运用的结果表明，EGFR基因外显子18~21的突变（体细胞突变）是患者对此类靶向药物有效的必要前提，如果病人不携带有EGFR基因突变而服用此类药物，不仅耽误病情还造成巨额药费的浪费。因此，在用药前筛查检测病人是否携带有EGFR基因突变显得尤为重要，也是未来肿瘤个体化治疗的发展方向。

目前，针对EGFR基因突变的检测方法主要有直接测序法、传统的荧光定量PCR法和高分辨率熔解曲线法。直接测序法耗时长且灵敏度低，通常只用于科研，难以用于临床的检测。传统的荧光定量PCR法难以使突变型基因在大量的野生型基因中得到专一性的扩增，容易产生假阳性的检测结果。高分辨率熔解曲线法所使用的仪器较特殊，难以在医院进行普及，而且此方法在检测缺失突变时，效果较差。因此，如何快速准确的检测这些与药物反应性有关的EGFR基因突变，就成为人们亟待解决的问题。

发明内容

为了克服现有技术检测能力的不足，本发明提供一种检测人类EGFR基因29种突变的引物、探针、试剂盒及检测方法。

本发明的目的是这样实现的：

一种用于检测人类EGFR基因突变的引物及探针，包括下列5组引物和探针中的至少一组：

(1)     5’- ggtgacccttgtctctgtgttcttgtcc-3’  SEQ ID NO: 1

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(2)     5’- gggcagcatgtggcaccatct-3’      SEQ ID NO: 6

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