[发明专利]一种基于抑癌基因的抗肝癌制剂及制备工艺

说明书

一、技术领域

本发明专利涉及一种基于腺病毒特异性表达的抑癌基因PTEN，可用于抑制肿瘤生长的抗癌制剂——甘露聚糖修饰的腺病毒-抑癌基因PTEN，即Manan-Ad5-PTEN，属于生物医药技术领域。

二、背景技术

目前对于肿瘤的治疗主要集中于手术、放疗和化疗等常规手段，但很多恶性肿瘤还是难以治愈，生物治疗已经成为肿瘤综合治疗的新模式，并受到越来越多的关注。由于癌症的产生是病毒或化学致癌物的作用使原癌基因激活成为癌基因，以及抑癌基因失活，引起细胞生长失控而形成，因此基因治疗的目的是通过外源基因的导入以修复或纠正病人体内基因表达系统，从根入手，阻断肿瘤的病理过程。

抑癌基因PTEN (Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten gene, PTEN)是1997年由Steck等3个研究小组分别发现并命名的一种新的抑癌基因。现已证实该基因的突变、失活与多种肿瘤的发生发展密切相关，成为继p16、p27和p53后又一具有重要意义的抑癌基因。目前已发现在多种肿瘤中存在PTEN基因的突变，如错构瘤综合征 (Cow den syndrome)、胶质瘤、前列腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、肺癌、肾癌、肝癌、膀胱癌、消化道肿瘤等。研究发现，PTEN基因的缺失、突变或表达产物的失活等，影响肿瘤的发生与发展。

基因的导入，根据载体的不同，可分为病毒转基因和质粒转基因两种。其中，以质粒为载体的基因治疗存在基因转染率较低的问题；病毒载体则具有更高的转染效率。腺病毒是目前基因治疗研究和临床试验中应用最广泛的病毒载体之一。由于腺病毒具有载体宿主范围宽广，感染效率高，可插入外源基因片段大，无插入突变等特点，因而受到特别的重视。但腺病毒载体介导的基因转移缺乏靶向特异性。在基因治疗的载体研究中，其中一个重要的研究方向是用配体或单克隆抗体对载体系统进行修饰，以提高靶组织、靶细胞对载体系统的摄取能力。研究发现，肝非实质细胞 (如Kupffer细胞和肝窦内皮细胞)和巨噬细胞的细胞膜上存在有甘露糖受体，它可以与含糖基的复合物结合。因此，通过一定的方式，利用甘露糖受体介导系统将腺病毒与甘露糖受体结合，可达到对肝脏的靶向性。

由于腺病毒存在潜在的免疫原性和毒性，并且体内应用时易被广泛存在的腺病毒抗体中和。为克服腺病毒的无靶向性、免疫原性以及在体内应用时易被腺病毒抗体中和等缺点，有研究者对病毒的衣壳蛋白进行聚乙二醇化，形成一种“隐形病毒”，逃避免疫系统的监视，降低了T细胞毒性和抗体的产生，进而延长了基因表达。本发明将腺病毒的衣壳蛋白通过甘露聚糖糖基化，可将重组腺病毒在体内靶向至DC细胞和肝癌细胞，诱导了抗肿瘤抗原的免疫应答；可延长基因表达，降低其免疫原性和毒性。

三、发明目的

本发明的目的在于充分利用腺病毒载体高效率转导基因的优点，避免其免疫原性和毒性的产生，制备一种利用抑癌基因原理有效抑制肿瘤生长的新型的抗肝癌制剂，为恶性肿瘤的治疗提供一种有效的治疗途径。

四、发明内容

本发明利用腺病毒转运抑癌基因PTEN，并利用甘露聚糖修饰腺病毒载体，从而制备了一种新型的抗肝癌制剂。

本发明涉及的抑癌制剂的具体制备方法如下：

第一步：特异性表达PTEN基因的重组腺病毒即Ad5-PTEN的大量扩增。利用微量的商品化的Ad5-PTEN腺病毒种源感染293细胞，48h后95%的细胞胞质收缩变圆呈葡萄串样，即判断为出现细胞病变效应（CPE）；收集细胞悬液，4℃，5000 rpm离心10 min，上清备用；将细胞重悬于2.0 mL完全培养基中，于液氮中冻结细胞，37℃水浴溶解，剧烈振荡，此步骤共进行4次；然后4℃，5000 rpm离心10 min，收集上清后合并前一步骤的病毒上清进一步感染100 mm培养皿中的细胞；细胞出现病变效应后，按照前述方法收集病毒，并进而将其感染150 mm培养皿中的293细胞，以获得足够量的病毒。