[发明专利]肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体融合蛋白及其制备方法

权利要求书

1.一种肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体与XVIII型胶原蛋白NC1域或三聚域的融合蛋白，该融合蛋白特征为：含有肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体TRAIL氨基酸序列114-281部分、肽接头和XVIII型胶原蛋白NC1域或三聚域，其中所述的肽接头长0-20个氨基酸，该肽接头存在于人TRAIL和人NC1或TD之间，且所述肽接头的氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸，所述肽接头为 [GlyGlyGlyGlySer]n ，n为0-4的整数。

2.根据权利要求1所述的一种肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体与XVIII型胶原蛋白NC1域或三聚域的融合蛋白，其特征在于：所述的融合蛋白包含与人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体残基序列相同的第一区和与人XVIII型胶原蛋白NC1域或三聚域残基序列相同的第二区，或上述二区的功能等同物。

3.权利要求1所述的一种肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体与XVIII型胶原蛋白NC1域或三聚域的融合蛋白构建以及融合蛋白包含体复性方法，通过以下步骤实现：

（1）构建重组融合蛋白基因，其中编码本发明融合蛋白的DNA序列的重组表达载体选用 pET28a-TRAIL-(G)n-NC1 质粒、pET24c-TRAIL-(G)n-TD 质粒；

（2）表达步骤(1)中的融合蛋白基因，并进行复性，其中大肠杆菌表达的融合蛋白形成包含体，经洗涤后得到较纯的融合蛋白包含体，然后结合稀释法和凝胶过滤法复性TRAIL-(G)n-NC1和TRAIL-(G)n-TD融合蛋白，得率分别在50%和90%以上；

融合蛋白包含体的复性过程包含稀释步骤和脱盐步骤：稀释步骤：将8M-10M 尿素溶解的融合蛋白包含体用包含助溶剂或变性剂的复性缓冲液A稀释至尿素终浓度为1M-4M，4℃静置6~12小时；脱盐步骤：将上述稀释后的融合蛋白用脱盐柱脱盐，其中流动相为包含蛋白稳定剂的复性缓冲液B，收集得到的蛋白组分即为所述的融合蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的助溶剂或变性剂是0M-2M L-精氨酸；复性缓冲液A为包含0M-2M L-精氨酸的磷酸缓冲液，pH 范围为6-8，复性缓冲液B为包含10-50%甘油的磷酸缓冲液，其pH范围为6-8。