[发明专利]硫化氢促进次生代谢物合成的新用途

说明书

技术领域：

本发明涉及硫化氢（H₂S）促进次生代谢物的合成，它属于生物工程技术领域。 

背景技术：

近年来，利用植物离体培养技术生产有用次生代谢物质的研究取得了很大的进展，如紫草细胞生产紫草素、人参细胞培养生产皂甙、洋地黄细胞培养生产生物碱等都达到工业化的生产规模，用长春花细胞培养生产抗癌生物碱已经达到了中试水平（刘春朝等，1997；胡立勇，2004）。然而次生代谢产物的低产现象是制约细胞培养植物天然产物技术产业化应用的核心问题之一，理解和掌握植物细胞次生代谢调控规律是解决这一问题的基础。虽然，国内外研究者针对植物培养细胞中次生代谢物低产问题进行了研究，包括优质细胞系的选育、培养条件的优化、培养技术改进以及活性物质合成关键酶基因的克隆等（郭肖红等，2005；徐茂军，2009；钱丹丹等，2011）。但到目前为止，植物细胞中次生代谢物的低产问题仍未得到很好的解决。 

诱导子是可以迅速、专一和选择性地诱导植物多种特定基因表达的物质，尤其是活化特定的次生代谢产物。如茉莉酸诱导子使金银花细胞中的齐墩果酸增加了9.4倍（Wiktorowska等，2010），真菌诱导子使亚麻细胞中的足叶草毒素含量增加了7倍（Bahabadi等，2012）。为此，诱导子被认为是提高药用植物次生代谢产物最有效的方法之一。但是在诱导子促进次生代谢物合成中发现，虽然大部分诱导子促进了目的代谢物的合成，却不同程度地抑制了细胞的生长，从最终次生代谢物产量上分析，其提高程度仍不能满足生产需求。如能找到同时促进细胞生长和次生代谢物积累的诱导子，将为解决植物细胞培养生产次生代谢物中低产的问题提供解决的思路。 

硫化氢(hydrogen sulfide，H₂S)是一种带有臭鸡蛋味的气体，在植物中H₂S的主要合成酶为半胱氨酸脱巯基酶，在L-或D-半胱氨酸脱巯基酶(磷酸吡哆盐依赖性酶)的作用下催化半胱氨酸降解成H₂S、丙酮酸盐和NH₄（Jin等，2011）。近年来的研究发现，H₂S具有促进种子萌发和提高植物抗逆反应等生理作用（侯智慧等，2011；Wei等，2011），而H₂S与次生代谢物的关系还未见报道。 

因此，我们期望明确H2S与次生代谢物的关系，找到同时促进细胞生长和次生代谢物积累的新诱导子，为解决植物细胞培养生产次生代谢物中低产的问题提供可靠的诱导子。

本发明的内容： 

本发明提供一种H₂S促进有用次生代谢物合成的用途。其特征在于（1）H₂S有效促进了桑黄菌丝中白桦酯醇和筋骨草悬浮细胞中蜕皮激素的合成（2）H₂S促进了桑黄菌丝和筋骨草悬浮细胞的生长。 

本发明的目的是提供了一种促进次生代谢物合成的新诱导子。 

为了更好的理解本发明，下面结合本发明的实施方案进一步说明本发明的实质性内容： 

具体实施方式：

下面实验分别从植物和微生物两种生物上研究H₂S对次生代谢物合成的影响。 

（1）H₂S对桑黄菌丝生长和白桦酯醇含量的影响；（2）研究H₂S对筋骨草悬浮细胞生长和蜕皮激素含量的影响。药品为H₂S的供体硫氢化钠。 

例1 

一、实验材料与方法 

（1）桑黄菌丝的培养条件 

取本研究室筛选出的产白桦酯醇的桑黄菌丝接入100ml马铃薯（PDA）液体培养基中，添加葡萄糖20g/L，接种量为60g/L，每隔15d继代一次，摇床转速为100-200rpm。 

（2）硫氢化钠的添加 

在菌丝生长的第8d加入H₂S的供体硫氢化钠，添加硫氢化钠的浓度为0.1nmol/L、0.5nmol/L、1nmol/L和2nmol/L，每个浓度处理重复3次，诱导4d后收获菌丝，测定菌丝的干重和菌丝中白桦酯醇的含量。 

（3）白桦酯醇的提取和测定 

白桦酯醇的提取和测定采用范桂枝等2007，张泽等2004的方法。提取试剂：95%乙醇；提取方法：超声波提取法；测定方法：高效液相色谱法，检测波长210nm，流动相为乙腈和水（V∶V＝8:2），流速1.0mL/min。 

二、研究结果