[发明专利]一种制备甲型流感病毒全长M2蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白的制备方法，特别涉及一种甲型流感病毒全长M2蛋白的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

M2蛋白是甲型流感病毒的非糖基化跨膜蛋白，由97个氨基酸组成，并且形成一个同源四聚体，具有离子通道、调节pH、帮助病毒脱壳的作用。

M2蛋白通常在病毒中含量少，而在感染的细胞中大量存在，相比于流感病毒的血凝素、神经氨酸酶的变异性，M2蛋白在所有甲型流感病毒中高度保守，几乎所有的流行株M2蛋白的序列同源性一样。经过10年的研究证实，M2蛋白的抗体可限制流感病毒的复制，减少动物的患病率、死亡率，以M2蛋白作为抗原研制的疫苗经动物实验表明安全有效（吕宏亮，刘松友，董小曼等.干扰素对M2e-HBc疫苗鼻内免疫的佐剂作用[J].医学研究杂志，2008，37(11):97-99；Tompkins S M,Zhao Z S,Lo C Y，et al.Matrix protein 2 vaccination and protection against influenza viruses,including subtype H5N1[J].Emerg Infect Dis,2007,13(3):426-435.）。

M2蛋白由于其高度疏水，且在流感病毒中含量甚微，所以提取或制备难度大，尚无全长M2蛋白制备的报道，为研究M2蛋白的抗原性、结构以及免疫学作用，本发明提出了全长流感病毒M2蛋白的制备方法及由制备得到的M2蛋白进一步获得多克隆抗体。

流感的预防、控制，无论季节性、大流行出现的变异，需要每年更换疫苗株，以疫苗株制备的诊断、预防、治疗的生物制品则需要长达6~8个月的周期。

甲型流感病毒M基因编码的M2蛋白在各亚型之间高度保守，以四聚体的形式存在。甲型流感病毒M2蛋白在甲型流感病毒H1、H3、H5、H5、H7、H9亚型上高度保守。

甲型流感病毒的M2蛋白胞外区域M2蛋白单独或联合NP免疫，据报道能够诱导动物保护性反应。还有和载体蛋白结合的疫苗、多抗原肽、昆虫杆状细胞表达的M2蛋白、M2质粒疫苗，均能在动物上产生保护性免疫。

发明内容

在流感病毒中由于M2蛋白的含量少以及疏水性，其表达多采用真核系统进行表达，且其表达、提取、纯化的难度大，成本比较高。针对以上问题，本发明采取原核表达系统，融合了纯化标签，结合了不同裂解剂的性质进行抽取，通过规模表达、提取和亲和纯化，使M2蛋白纯度达98%以上并具有生物活性（非包涵体形式，可溶性），采用15升的发酵罐进行发酵可得1~1.5mg的M2蛋白，可满足M2蛋白结构与功能的研究，如X-ray、质谱，以M2蛋白为基础的生物制备研究，如疫苗、治疗性抗体、诊断试剂。

本发明所要解决的技术问题是提供一种制备甲型流感病毒全长M2蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）合成甲型流感病毒全长M2蛋白基因；

（2）基因合成后，插入克隆质粒；

（3）根据甲型流感病毒全长M2蛋白基因序列，设计用于扩增甲型流感病毒全长M2蛋白基因的引物，在上游引物的3’端引入BamHI酶切位点，在下游引物的3’端引入HindⅢ酶切位点及6个组氨酸标签序列，以合成的甲型流感病毒全长M2蛋白基因为模板扩增甲型流感病毒全长M2蛋白基因，产物与用同样酶切后的pMAL-p2X表达质粒片段连接；

（4）连接产物转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，测序，得到pMAL-p2X MBP-M2-6×His重组质粒；

（5）重组质粒pMAL-p2X MBP-M2-6×His接种LB培养基，按1:2000~1:300（V/V）转接到含有10L LB培养基的15L的发酵罐中，以200rpm转速37℃培养4~6h，菌液OD600达到0.5~0.6时，接种浓度0.5~0.7mmol/L加入IPTG诱导4h，4000rpm离心40min，获得细菌培养物25~30g；

（6）细菌膜蛋白提取和纯化

a细菌膜蛋白提取

将步骤（5）得到的细菌培养物在冰浴中完全融化，重悬于层析平衡液中，超声破碎后以100,000g离心1h分离上清和沉淀，沉淀重悬于层析平衡液，加入不同的裂解剂在4℃搅拌2h提取膜蛋白，测定提取物的活性，以确定总蛋白和裂解剂的比例，提取物以100,000g离心1小时，获得可溶性上清，再用层析平衡液稀释至最终裂解物的浓度为1.0%（w/v）以便于后续纯化；