[发明专利]一种抗HIV-1药物的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种抗HIV-1药物的筛选方法。

背景技术

艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)为当前在全球范围内流行的重大传染病之一，是由人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染导致人体免疫机能缺陷,而易于发生机会性感染和肿瘤的临床综合征。在过去的20多年里造成2000多万人死亡，目前全世界艾滋病病毒感染者已达4000万左右，艾滋病对人类健康，社会稳定造成严重威胁。在艾滋病疫苗尚未研制成功的现阶段，药物治疗是艾滋病防治的主要手段。目前已经有4类24种抗逆转录病毒药物应用于艾滋病的抗病毒治疗，包括11种核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)，3种非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)，9种蛋白酶抑制剂(PI)和1种融合抑制剂(FI)。但病毒的进化使得耐药性不断产生，这就需要不断寻求针对新靶点的新型抗艾滋病病毒药物。

引起世界范围流行的艾滋病的病原体主要是人类免疫缺陷病毒1（Human immunodeficiency virus type1,HIV-1），HIV-1的致病机理及其与宿主因素的相互作用十分复杂。对抗病毒的宿主细胞因子Tsg101、APOBEC3G等越来越受到关注。因此，了解病毒与宿主的关系及其相互作用机制是寻找有效的抗病毒药物和治疗策略的新途径。病毒在进化过程中需要不断的克服宿主细胞的限制作用才能得以在宿主体内生存，其中HIV-1自身的辅助蛋白Vpu可克服宿主限制因子BST-2（bone marrow stromal cell antigen2，又称CD317，HM1.24），从而促进病毒从宿主细胞的释放。

BST-2因最近发现能抑制HIV-1的释放而引起了科学界极大的关注，它能将新生的病毒粒子粘附于病毒感染细胞表面又得名Tetherin。BST-2是一种拓扑结构较为独特的膜蛋白，含有两个疏水区。该蛋白质的氨基端位于胞质中，随后是一个约19个氨基酸的跨膜蛋白域（TM）及胞外卷曲螺旋基序，其羧基端为约17个氨基酸的糖基磷脂酰肌醇锚定点（GPI anchor）。位于细胞表面的BST-2，其GPI锚定点位于病毒出芽部位-脂伐中，而跨膜区位于脂伐外，通过胞外的半胱氨酸残基形成二聚体或多聚体的形式而将出芽的病毒和宿主细胞连接，使病毒粒子束缚于细胞表面，从而抑制病毒的释放。

如前所述，BST-2的这种抑制病毒释放的作用可被HIV-1的辅助蛋白Vpu拮抗。Vpu也为跨膜蛋白，具有两个主要的结构域：氨基端的疏水跨膜域和羧基端的具有两个可磷酸化丝氨酸残基的胞质域。Vpu可与BST-2共定位，两种蛋白通过各自的跨膜区产生相互作用，进而通过胞质区的β-TrCP结合位点，将BST-2与细胞内的泛素化通路相连，以内体-溶酶体途径或蛋白酶体途径降解BST-2，使其在细胞表面的含量减少，从而促进HIV-1病毒粒子的释放。因此，可将BST-2与Vpu跨膜区的相互作用作为新的药物靶标，破坏两者相互之间的联系，抑制Vpu降解BST-2，从而恢复BST-2向细胞表面的运输而达到病毒释放减少的目的。

BRET（Bioluninescence resonance energy transfer生物发光共振能量转移）为一种在活细胞内实时监测两种蛋白质相互作用的方法。此方法将两种目标蛋白各自与生物发光共振能量转移供体蛋白（如Renilla的荧光素酶，Rluc）和受体蛋白(如EYFP)融合表达，当两种目标蛋白产生相互作用时，距离会小于10nm，这时加入外源底物(如Coelenterazine h)而使Rluc产生激发光，此激发光可由一对偶极子介导向受体蛋白EYFP转移，从而激发EYFP产生发射光，通过仪器可检测蛋白质发生作用前后的信号变化，是一种研究蛋白质之间相互作用的良好方法。

目前国内关于艾滋病药物筛选的方法层出不穷，但方法不够简便，或者作用机制不甚明确，因此，亟待推出新的简单高效，能够实现高通量并且机制明确的药物筛选方法。

发明内容

针对上述不足，本发明提供一种抗HIV-1药物的筛选方法。

本发明提供的抗HIV-1药物的筛选方法，包括步骤：添加待检样品至能稳定表达RB和VE的细胞系的细胞中，检测细胞BRET信号的变化，若BRET信号下降，则待检样品为抗HIV-1阳性药物；所述RB是将BST-2的氨基端与生物发光共振能量转移供体蛋白连接而成的，所述VE是将Vpu的羧基端与生物发光共振能量转移受体蛋白连接而成的，使BST-2和Vpu之间产生BRET信号。