[发明专利]一种抗除草剂阿特拉津的特异性抗体

权利要求书

1.除草剂阿特拉津的人工抗原和抗体其特征在于使用分子式为

的半抗原与牛血清白蛋白(BSA)连接合成人工抗原，与辣根过氧化物酶(HRP)连接合成酶标抗原，其中人工抗原再经过免疫新西兰大耳兔，取血，分离出抗血清，纯化制得抗体；

2.权利要求1所述的除草剂阿特拉津人工抗原的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得：

(1)半抗原的合成

①准确称取3.00g的三聚氯氰溶于120mL的乙醚溶液中(溶液I)，分别取异丙胺1.45mL和三乙胺2.43mL于15mL的乙醚溶液中(溶液II)，溶液I和II均放置于-20℃冰箱预冷，在冰浴搅拌的条件下，将溶液II逐滴加入溶液I中，滴加过程中会产生大量的白色沉淀，加完后，室温搅拌反应16h，薄层色谱法追踪是否反应完全，所用展开剂中正己烷、乙酸乙酯和冰醋酸的体积比为10∶1∶0.2。反应完全后，将上述溶液过滤除去沉淀，滤液依次用4℃预冷的HCl(7.5mL，0.1mol L^-1)，NaHCO₃(7.5mL，0.1mol L^-1)和饱和NaCl水溶液(15mL，2次)洗去杂质，有机相中加入适量的无水Na₂SO₄过夜，除去溶液中的水后，蒸干乙醚便得到三聚氯氰的取代物。

②分别取上述取代物0.375-0.400g和4-氨基丁酸0.205g溶于40mL的无水乙醇中，超声溶解完全后，向其中加入三乙胺0.55mL，搅拌条件下，80℃加热回流反应24h，薄层色谱法追踪反应是否完全，所用展开剂中正己烷、乙酸乙酯和冰醋酸的体积比为5∶1∶0.1。反应完全后蒸干溶剂，得到的沉淀用100mL 5％的NaHCO₃溶液复溶，然后用30mL CH₂Cl₂萃取3次除去杂质，最后，水相用6mol L^-1的盐酸调PH至1，此过程会产生白色沉淀，干燥即得到目标产物。

(2)活化酯的制备

首先移取600μL的无水DMF于2mL的小棕瓶中，称取半抗原(4.97mg，0.018mmol)溶于DMF中并超声5min使其溶解充分，在搅拌的状态下，依次向其中加入DCC(18.75mg，0.09mmol)和NHS(10.46mg，0.09mmol)，溶解充分以后，室温避光搅拌反应24h。反应后溶液中有沉淀产生，4℃，10000r/min离心5min除去沉淀，上清即为活化酯液；

(3)人工抗原的合成

将上述活化酯溶液逐滴加入冰浴条件下的4mL含20mg BSA的PBS溶液中，室温搅拌1h后，将该溶液置于4℃冰箱搅拌过夜，然后将反应液吸出装入透析袋，在4℃条件下用pH7.4的0.01mol L^-1PBS溶液透析三天，每天换四次透析液，最后将透析液取出分装，-20℃保存；

3.权利要求1所述的阿特拉津酶标抗原的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得：

首先移取200μL的无水DMF于2mL的小棕瓶中，称取半抗原(1.64mg，0.0006mmol)溶于DMF中并超声5min使其充分溶解，在搅拌的状态下，向其中依次加入EDC(5.75mg，0.03mmol)和NHS(3.45mg，0.03mmol)，溶解完全以后，室温避光搅拌反应24h。反应后将该活化酯溶液逐滴加入冰浴条件下的2mL含5mg HRP的0.05mol L^-1 K₂HPO₄溶液(pH 9.1)中，室温搅拌1h后，将该溶液置于4℃冰箱搅拌过夜，然后将反应液吸出装入透析袋，在4℃条件下用pH 7.4的PBS溶液透析三天，每天换四次透析液，最后将透析液加入等体积的甘油，混匀后分装，并于-20℃保存。

4.权利要求1所述的除草剂阿特拉津抗体的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得：

免疫动物选用雄性新西兰大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后进行四次加强免疫，加强免疫分别于初次免疫后2周、4周，6周和8周后免疫四次，免疫后9天由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测，具体做法是：

初次免疫：取1mg按照权利要求2所述方法合成的人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏完全佐剂等体积所配制的溶液中，进行动物免疫；

加强免疫：用1mg上述人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏不完全佐剂等体积所配制的溶液，进行动物免疫；

抗体纯化：定时监测动物抗体效价，当抗体对一定的包被抗原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，使用G-Sepharose蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化，获得抗阿特拉津的特异性抗体。