[发明专利]一种基于分裂锁式探针的多重RCA方法

权利要求书

1.一种基于分裂锁式探针的多重RCA方法，其特征在于：具体操作步骤为：步骤一、连接反应：将靶序列DNA片段与终浓度为0.1μmol/L的四种分裂锁式探针混合煮沸变性后，立即置于冰上冷却5min，升温至37℃，杂交15min，加入2.5U的T4DNA连接酶和1μL的T4DNA连接酶缓冲液，去离子水补足10uL反应体系，连接反应时间：45min，再加入10U exonuclease I和10Uexonuclease III，37℃，反应15min，制备出含有环状模板的连接产物；其中T4DNA连接酶缓冲液的成份为40mmol/L Tris-HCL,10mmol/L MgCL₂,10mmol/L DTT和0.5mmol/L ATP；

步骤二、滚环扩增反应反应：取步骤一制得的混合连接产物10μL，与通用引物，其碱基序列如序列表序列10，混合煮沸变性后，分别加入摩尔浓度为的10mmol/LdNTP2μL，phi29DNA聚合酶10U，HhaI限制性内切酶10U和由33mmol/Ltris-Ac、10mmol/LMgAC₂、6mmol/LKAC和0.1μg/μLBSA组成的缓冲液2μL，去离子水补足20uLRCA反应体系，温度37℃，反应时间60min；

步骤三、RCA单链DNA产物检测：RCA反应结束后，取反应产物采用1%琼脂糖凝胶电泳、RCA单链产物测序、荧光定量RCA扩增或表面等离子体共振生物传感器检测方法中的一种方法进行检测。

2.如权利要求1所述的一种基于分裂锁式探针的多重RCA方法，其特征在于：所述的分裂锁式探针，包括以下4个部分：

1）检测臂：探针的5′端和3′端为检测臂，检测臂与靶序列完全互补，只有当与靶序列完全碱基互补结合时，才可在连接酶作用下使探针两端连接环化；

2）通用引物区：探针的引物结合区为滚环扩增的通用引物区，实现混合靶序列的多重滚环扩增；

3）酶切区域：探针右侧的酶切区域包含一个硫代磷酸化的HhaI限制性内切酶位点，生成的单链产物携带该位点，将在扩增的同时被HhaI限制性内切酶切成与环状探针相同大小的单链DNA片段产物，而探针本身由于硫代磷酸化的保护而不会被酶切，从而始终作为模板进行复制；

4）特异性标签序列：探针左侧的标签序列区使RCA单链DNA产物带有各自的特异性标签序列，可与芯片表面固定的互补标签序列探针特异性碱基互补结合，实现多重扩增产物的特异性检测。