[发明专利]一种结核分枝杆菌特异性融合蛋白及其制备和应用

权利要求书

1.一种结核分枝杆菌特异性融合蛋白，其由38kDa、Rv0577、Rv1271c三种蛋白的抗原表位依次连接构成，38kDa蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列1所示；Rv0577蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列2所示；Rv1271c蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌特异性融合蛋白，其特征在于：所述的38kDa蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Rv1271c蛋白的抗原表位位于融合蛋白的梭基端。

3.权利要求1或2所述的结核分枝杆菌特异性融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1）应用分子生物学软件分析结核分枝杆菌38kDa、Rv0577、Rv1271c的基因序列和蛋白质结构，确定三个蛋白抗原表位融合的区域、组合和顺序；依次将38kDa、Rv0577和Rv1271c蛋白抗原表位连接，形成融合蛋白；38kDa蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Rv1271c蛋白的抗原表位位于融合蛋白的梭基端；

（2）三个蛋白融合的克隆：

①在38kDa上游引物添加Xba I酶切位点和编码3个疏水性氨基酸的的DNA序列，在38kDa下游引物添加编码3个疏水性氨基酸的DNA序列和Spe I、Hind III酶切位点，将PCR扩增产物用Xba I和Hind III双酶切后，插入用Nhe I和Hind III双酶切后的pET30aSETB质粒载体中；转化到大肠杆菌DH5α受体菌中；经过质粒提取，经T7和T7t双向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒38kDa/pET30aSETB；

②在Rv0577上游引物添加Xba I酶切位点，在Rv0577下游引物添加编码3个疏水性氨基酸的DNA序列和Spe I、Hind III酶切位点，将PCR扩增产物用Xba I和Hind III双酶切后，插入用Xba I和Hind III双酶切后的pET30aSETB质粒载体中；转化到大肠杆菌DH5α受体菌中；经过质粒提取，经T7和T7t双向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒Rv0577/pET30aSETB；

③在Rv1271c上游引物添加Nhe I酶切位点和编码1个疏水性氨基酸的DNA序列，在Rv1271c下游引物添加Hind III酶切位点，将PCR扩增产物用Nhe I和HindIII双酶切后，插入用Nhe I和Hind III双酶切后的pET30aSETB质粒载体中；转化到大肠杆菌DH5α受体菌中；经过质粒提取，经T7正向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒Rv1271c/pET30aSETB；

④用Spe I和Hind III双酶切38kDa/pET30aSETB质粒作为载体；用Xba I和Hind III双酶切Rv0577/pET30aSETB质粒，获得的Rv0577片段插入38kDa/pET30aSETB质粒载体中；转化到大肠杆菌DH5α受体菌中；经过质粒提取，分别以38kDa和Rv0577上游和下游引物进行PCR扩增鉴定，阳性重组质粒命名为38kDa-Rv0577/pET30aSETB；

⑤再用Spe I和Hind III双酶切38kDa-Rv0577/pET30aSETB质粒作为载体；用Nhe I和Hand III双酶切Rv1271c/pET30aSETB质粒，获得的Rv1271c片段插入38kDa-Rv0577/pET30aSETB质粒载体；转化到大肠杆菌BL21（DE3）受体菌中；经过质粒提取，经T7和T7t双向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒38kDa-Rv0577-Rv1271c/pET30aSETB；并使38kDa抗原表位与Rv0577抗原表位之间以及Rv0577抗原表位与Rv1271c抗原表位之间通过连接臂相连接。

4.权利要求1或2所述的结核分枝杆菌特异性融合蛋白在制备结核抗体诊断试剂盒中的应用。