[发明专利]一种检测基因序列的方法

权利要求书

1.一种检测基因序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.将第一锚定引物锚定结合于含基因序列的待测核酸片段的第一接头上；

B.在第一锚定引物延伸末端分别连接带不同位置标记的荧光探针，并检测相应的连接产物的荧光信号，得到第一锚定引物延伸末端后M个核苷酸的序列信息；

C.利用内切酶将步骤B中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得到带有含有待测序片段的酶切产物；

D.酶切产物连接第二接头得到新的含基因序列的待测核酸片段，将第二锚定引物结合于新的含基因序列的待测核酸片段的第二接头上；

E.在第二锚定引物延伸末端分别连接带不同位置标记的荧光探针，并检测相应的连接产物的荧光信号，得到第二锚定引物延伸末端后N个核苷酸的序列信息；

F.更换试剂，对前一步骤的产物进行酶切、接头连接、锚定引物结合、荧光探针连接和荧光信号检测；

G.重复步骤F，直至得到含基因序列的待测核酸片段中所需的基因序列信息；

其中，M、N均为正整数；所述基因为等位基因或抗肿瘤药物相关基因。

2.根据权利要求1所述的检测基因序列的方法，其特征在于，步骤A中所述第一锚定引物带有含有至少一个酶切识别位点。

3.根据权利要求2所述的检测基因序列的方法，其特征在于，所述步骤C包括以下步骤：

C1.将步骤B中连接的荧光探针与第一锚定引物洗脱，重置第一锚定引物并进行链延伸，与含基因序列的待测核酸片段形成双链核酸分子；

C2.内切酶通过识别第一锚定引物上所带的酶切识别位点并进行酶切，将步骤B中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得到含有待测序片段的酶切产物。

4.根据权利要求1所述的检测基因序列的方法，其特征在于，步骤C包括以下步骤：

C1’.在第一锚定引物的另一端连接双链的第三接头，该第三接头带有含有至少一个酶切识别位点；

C2’.利用内切酶识别第三接头所带的酶切识别位点，将步骤B中已得到序列信息的核苷酸部分或完全切除，得到含有待测序片段的酶切产物。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的检测基因序列的方法，其特征在于，所述第一锚定引物带有含有至少一个特异性残基和/或一端是封闭的。

6.根据权利要求5所述的检测基因序列的方法，其特征在于，所述步骤B包括以下步骤：

B1.在带有含有特异性残基的第一锚定引物延伸末端连接带特定位置标记的荧光探针，检测相应的连接产物的荧光信号，得到对应位置的核苷酸序列信息；

B2.以特异性切割剂切割特异性残基，将前一步骤中连接的荧光探针及第一锚定引物洗脱，重置第一锚定引物；

B3.在第一锚定引物延伸末端重复带特定位置标记的荧光探针的连接和检测相应连接产物的荧光信号的操作，得到第一锚定引物延伸末端后M个核苷酸的序列信息。

7.根据权利要求1所述的检测基因序列的方法，其特征在于，步骤A中所述含基因序列的待测核酸片段固定于固相载体表面。

8.根据权利要求7所述的检测基因序列的方法，其特征在于，在步骤A之前还包括步骤：

A0.利用固相载体对基因序列进行扩增，得到固定于固相载体表面的含基因序列的待测核酸片段。

9.根据权利要求8所述的检测基因序列的方法，其特征在于，所述步骤A0包括以下步骤：

A01.将用于扩增的含基因序列的核酸片段固定于固相载体表面，得到表面带有含有至少一个含基因序列的核酸片段的固相载体；

A02.将引物结合于固相载体表面上的引物结合位点，得到固定有引物的扩增载体；

A03.对扩增载体上的核酸片段进行扩增，得到固定于固相载体表面的含基因序列的待测核酸片段。

10.根据权利要求9所述的检测基因序列的方法，其特征在于，步骤A02中所述引物包括用于对所述含基因序列的待测核酸片段进行扩增的上游引物和/或下游引物，所述上游引物是与含基因序列的待测核酸片段5’端互补结合的核酸序列，所述下游引物是与含基因序列的待测核酸片段3’端序列相同的核酸序列。

11.根据权利要求9所述的检测基因序列的方法，其特征在于，步骤A03中所述的扩增是单分子扩增。