[发明专利]棉大卷叶螟吐丝基因片段及其克隆方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及棉大卷叶螟丝素轻链蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列，并涉及该基因的用途。

背景技术

棉大卷叶螟（Sylepta derogata Fabricius）是一种分布极广且寄主广泛的多食性害虫。属鳞翅目螟蛾科，曾是棉田中重要的食叶性害虫，大发生时，卷食棉叶，影响棉花的结铃和最终产量。由于有机磷杀虫剂的大量使用，该虫的为害渐轻。但近些年随着转基因棉花的大面积种植，化学杀虫剂用量的大幅度下降等原因，棉大卷叶螟在一些棉田的种群数量呈现上升趋势，为害日渐严重，甚至造成整株叶片卷曲或被食光，棉株仅留下枝、茎，严重影响棉花的现蕾开花及最后的产量，成为近几年我国长江中下游棉区棉花上较为重要的食叶性害虫。

棉大卷叶螟在5月上、中旬平均气温达20℃时开始化蛹羽化。一、二代主要在木槿、苘麻等植物上繁殖为害，第三代开始迁移到棉田。8月中旬至9月下旬是棉大卷叶螟为害棉田的盛期，也是棉花受害最严重的时期。

棉大卷叶螟具有很强的繁殖能力，每头雌蛾平均产卵180～260粒，最高达400粒，卵大多数散产于棉叶背面，以叶脉边缘分布较多。幼虫多在下午及夜间孵化，幼虫历期约为25天，初孵幼虫喜欢群集在叶片背面取食叶肉，留下表皮；进入2、3龄以后开始分散吐丝，将棉叶卷成喇叭状，并躲藏于卷叶内取食。大发生时，一张棉叶可被卷成2～3个喇叭筒，一般一个卷筒内仅有1头幼虫，且喜转移危害。在食源充足时棉大卷叶螟幼虫常不食光被卷的叶片即转移，食源匮乏或虫量较大时整株叶片被卷曲，大发生时叶片可被全部食光。

由于棉大卷叶螟有吐丝卷叶为害的特性，普通农药对棉大卷叶螟的防治效果不甚理想，使得棉大卷叶螟的为害逐年加重。因此，能克隆到与卷叶螟吐丝相关的基因序列，对棉大卷叶螟的防治有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于阐明了昆虫丝腺泌丝因子的一种基因序列、氨基酸序列。

本发明根据以往报道的外米缀蛾和大蜡螟轻链基因序列，设计引物，采用同源基因克隆策略和PCR技术，扩增中间片段，再根据测序结果，设计3’和5’引物，使用RACE法，分别扩增出3’和5’区段，测定序列后拼接成完整的基因序列，再使用ORF Finder分析得到棉大卷叶螟丝素蛋白基因轻链基因部分的开放阅读框。

本发明所述的棉大卷叶螟丝素轻链基因序列如SEQ ID NO.1所示；该基因cDNA全长1087bp，自46bp至849bp区段为其开放阅读框，编码267个氨基酸(SEQ ID NO.2)，5’非编码区长45个碱基，3’非编码区长238个氨基酸，有多聚核苷酸尾巴。

由上述基因码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的棉大卷叶螟丝腺中的轻链基因序列，可在减轻棉大卷叶螟的吐丝卷叶危害中得到应用。

所述的棉大卷叶螟丝腺中的轻链基因序列，可在靶标作物中导入该基因，作为转基因素材。

所述的棉大卷叶螟丝腺中的轻链基因序列，可作为其它众多农林吐丝害虫目的基因的参考。

附图说明

图1是中间产物PCR检测结果；

图2是中间片段胶回收结果；

图3是菌液PCR检测结果；

图4是3’RacePCR检测结果；

图5是3’Race胶回收结果；

图6是3’Race菌液PCR检测结果；

图7是5’RacePCR检测结果；

图8是5’Race胶回收结果；

图9是5’Race菌液PCR检测结果；

图10是RT-PCR扩增结果；

图11是酶切后结果的检测；

图12是CTE927-1表达SDS-PAGE图像；

图13是CTE927-1SDS-PAGE图像；

图14是CTE927-1转膜后SDS-PAGE图；

图15是CTE927-1PVDF膜图像。

图1－9中M为DL2000DNA分子量标准。

具体实施方式

实施例一

1、Total RNA的提取

RNA的提取使用的是Promega公司的SV Total RNA Isolation System试剂盒，具体方法如下：

1）在一个无菌小离心管中加入1mL的RNA Lysis Buffer(加BME)。