[发明专利]HLA-A0201限制性抗CEA抗原特异性CTL的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术开发与应用研究领域，涉及HLA-A0201限制性抗CEA抗原特异性CTL制备方法。

背景技术

一、肿瘤治疗的困境与机会

恶性肿瘤已成为人类第一号“杀手”，手术、放疗与化疗是治疗肿瘤的三大常规方法，能在短期内有效的减轻肿瘤负荷，但仍不能有效清除肿瘤细胞。微小残留病灶、对放疗、化疗的部分敏感和耐药是肿瘤复发及转移的根源，而复发与转移正是肿瘤患者死亡的主要原因。常规治疗方法已力不从心，开发新型的肿瘤治疗技术与产品迫在眉睫。

二、细胞免疫治疗技术的诞生与发展

上世纪80年代起免疫学与肿瘤学的迅速发展，1982年美国NIH Rosenberg教授为首的研究小组研制出淋巴因子活化的杀伤细胞（LAK）免疫疗法，并在后续研究中对LAK细胞的临床应用进行了深入的探讨。但是LAK细胞杀伤力不够强，临床应用需要大量输注（3×10^10-11），另一方面扩增能力有限，需要在输注细胞的同时大剂量应用白细胞介素-2（IL-2）（10万IU/kg，q8h），因而产生了相关的不良反应。而后Rosenberg又提出了肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），其杀瘤能力较LAK有了明显提高，并且无需大剂量IL-2联合应用，但细胞需要从肿瘤组织中分离获得，这极大限制其广泛的临床应用。在以上的工作基础上，1991年Stanford大学的Schmidt-Wolf等采用干扰素γ（IFN-γ）、IL-2和鼠抗人CD3单克隆抗体（Mouse anti-HumanCD3mAb）共同诱导出了具有强大抗肿瘤活性的细胞群，命名为细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）。

树突状细胞（DCs）是迄今为止已知的体内功能最为强大的专职抗原递呈细胞（APC），其表面存在丰富的抗原捕获分子，抗原递呈分子（MHC I类和MHC Ⅱ类分子），免疫共刺激分子（CD80、CD83、CD86、CD40等）。经抗原刺激后的DC细胞向淋巴结迁移，将其携带的抗原信息传递给相应的T淋巴细胞，启动、激发CD4+/CD8+T细胞免疫应答，特异性地杀灭肿瘤细胞。同时经抗原刺激后的DCs可分泌白细胞介素-8（IL-8）、干扰素α（IFN-α）、白细胞介素-12（IL-12）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等，增强机体非特异性免疫应答（天然免疫），故DC有“天然免疫佐剂”的美称，其发现者Ralph Steinman教授获得2011年诺贝尔医学奖。鉴于DC在机体免疫防御系统中所处的中心地位，基于DC开发的抗肿瘤疫苗已使之成为最先进、最有希望的肿瘤免疫治疗技术之一，近年来国内外学者对其进行了广泛的探索。1992年Stanford医学院的2位教授成立了世界上第一家以DC为基础的肿瘤疫苗公司(Dendreon，CA)，该公司的产品Provenge已于2010年4月29日获得FDA批准上市。但是DC在体内的功能受到患者本身免疫状态，肿瘤微环境的影响，而肿瘤患者体内存在大量抑制因子，因此DC的体内效果并不如体外效果理想。

细胞毒性T淋巴细胞（CTL）构建是近期兴起的免疫治疗技术，因其具有特异、直接杀伤肿瘤靶细胞的能力，因此成为研究的热点。

三、癌胚抗原（CEA）在肿瘤免疫治疗中的作用

癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen,CEA）是1965年首次在肠道肿瘤及胚胎消化道中被发现的，由686个氨基酸组成，分子量为18～20kD。近来研究证实CEA是免疫球蛋白超基因家族的成员之一，可能参与细胞识别与细胞间反应，且CEA还是一种粘附因子，可促进肿瘤细胞与正常细胞的结合，并对肿瘤的转移起重要作用。因此CEA不仅是一种单纯的肿瘤标志物，而且是与肿瘤恶性化有关的分子，在多种肿瘤中表达。超过90%的原发性结直肠癌表达CEA，尤其是在肝转移患者中，血清CEA浓度在80%肝转移患者中升高。胃癌患者血清CEA的阳性率在40%左右，且与分期有关，随病程进展逐渐升高。40%-80%的肺癌患者出现CEA升高，血清CEA水平与治疗的反应性及预后有较好的相关性。CEA亦可产生自乳腺组织。因此CEA可以作为肿瘤免疫治疗的有效靶抗原。

CEA抗原高表达的肺癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌的发病率和死亡率均是排名前三位的肿瘤，而目前还未有针对CEA抗原的药物上市，因此开发新型针对CEA靶点的药物势在必行。抗CEA特异性CTL的开发是一种发展方向。

四、CTL作用机理

1、机体T细胞免疫反应过程