[发明专利]焦磷酸测序法检测GSTP1基因多态性的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测GSTP1基因多态性的试剂盒及方法。

背景技术

人类谷胱甘肽S转移酶P1（GSTP1）是体内最重要的Ⅱ相解毒酶，主要催化GSH与多种外源性化学物在体内的活性代谢产物结合，在很多癌症化疗药物的解毒代谢中起重要作用。

铂类抗癌药是临床上的一线化疗药物，用于多种肿瘤的化疗。常见的有顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、乐铂等。GSTP1 rs1695 (Ile105Val)突变导致酶活性显著降低，降低了铂类化疗药物的代谢清除率，延长了铂类化疗药物对肿瘤的作用，因此患者化疗后生存率显著增加，但应关注药物毒副作用。有研究报道奥沙利铂治疗的患者中，发生3级神经毒性23%为Ile105Ile野生型纯合子，77%为105Val突变携带者。经正规治疗的Val105Val突变纯合子患者晚期结直肠癌患者的相同时间生存率约为75%； Val105Val杂合子患者晚期结肠直肠癌患者的相同时间生存率约为40%；Ile105Ile野生型纯合子相同时间生存率仅为5%。

蒽环类（Anthracyclines）化疗药物是临床常用的抗肿瘤抗生素药物，主要包括阿霉素、表阿霉素等，是一类细胞周期非特异性化疗药。其主要药理作用是通过嵌入DNA碱基对之间，抑制拓扑异构酶II的催化活性，导致DNA断裂。GSTP1参与蒽环类的代谢过程，是影响蒽环类药物需经肝脏代谢活化后起效的重要酶。GSTP1遗传多态性对蒽环类化疗药物的疗效或毒性反应有重要影响。其rs1695位点发生A>G将引起Ile105Val，从而降低酶的活性，导致蒽环类药物的活化效率降低。携带A/A（70.5%）基因型疗效较差。反之，携带G/G（2.6%）等位基因患者对化疗更为敏感，疗效较好。有研究表明、接受蒽环类抗生素化疗的结直肠癌患者中携带G/G等位基因较携带A/A基因型对化疗更为敏感，疗效更好。

综上所述，GSTP1基因多态性可作为铂类化疗药物、蒽环类抗生素等药物疗效预测的有效指标，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测GSTP1基因多态性的试剂盒将为GSTP1底物药(如铂类、蒽环类抗生素等)的临床个体化治疗起到积极的推动作用。

焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种   通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。

发明内容

本发明旨在提供一种焦磷酸测序法检测GSTP1基因（SEQ ID NO.1）多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测GSTP1基因多态性，利于临床个体化使用GSTP1的底物药(如铂类、蒽环类抗生素等)。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述焦磷酸测序发检测GSTP1基因多态性的试剂盒，包括如下引物：

（1）扩增引物：

     上游引物：5’-CTG GTG GAC ATG GTG AAT-3’（SEQ ID NO.2）；

     下游引物：5’-CCC AGT GCC CAA CCC TGG-3’（SEQ ID NO.3）；

其中，下游引物的5??进行生物素标记；

（2）测序引物：5’-CCT CCG CTG CAA ATA-3’（SEQ ID NO.4）；

在实际应用中，可以对上述引物作适当改变，只要保证设计的引物与上述引物同源性达95%以上即可；试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。

所述应用上述试剂盒检测GSTP1基因多态性的方法，包括如下步骤：

（1）DNA提取；

（2）聚合酶链反应：

配制50μl PCR扩增体系，包含：10×PCR buffer 5.0μl，dNTP 1.5μl，GSTP1-上游引物 0.5μl，GSTP1下游引物0.5μl，rTaq0.5μl，水40μl，模板2μl；循环程序为：95 ℃ 5min预变性；依次在95^oC 30S，55^oC 30S，72^oC 15S，进行35个循环；72^oC 保持5min，最终保持在4℃，得扩增产物；

（3）焦磷酸测序单链样本纯化；

（4）焦磷酸测序及结果分析。