[发明专利]矮牵牛离体茎尖的超低温保存方法

权利要求书

1.一种矮牵牛离体茎尖的超低温保存方法，其包括材料扩繁、茎尖剥取、预培养、装载、PVS2处理、超低温冷冻保存的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，材料扩繁具体步骤如下：

1）将矮牵牛试管苗接种在含0.5mg/L BA和30g/L蔗糖的MS固体培养基上进行扩繁；

2）将扩繁的试管苗转移到不含激素的MS培养基中生根复壮，20d后，将生根苗转到含30g/L蔗糖的MS培养基中培养；培养温度为25±2℃，光照14h/d，光照强度为700lux。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，茎尖剥取具体为：在无菌条件下，从继代15-20d的矮牵牛无菌苗上剥取带2-3片叶原基，直径大小约2~3mm的离体茎尖为材料。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，预培养具体为：将剥取的茎尖在含0.2~0.4mol/L蔗糖的MS液体培养基中，于25℃振荡预培养1~3d，摇床转速为60rpm/min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，装载具体为：将预培养后的离体茎尖置于装载液中室温装载20~40min；所述装载液的组成为：MS+2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，PVS2处理具体为：将装载后的茎尖置于PVS2中，0℃处理30~50min；所述PVS2的组成为：MS+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，超低温冷冻保存具体为：将经PVS2脱水处理后的茎尖置于铝箔条上，向茎尖上滴加PVS2溶液，使茎尖完全包裹于PVS2溶液小滴中，然后将铝箔条直接浸入液氮中进行冷冻，冷冻后将铝箔条装入冻存管中，拧紧盖子，最后投入液氮中保存。

8.根据权利要求1-7任一项所述方法获得的矮牵牛离体茎尖在组织培养中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将超低温冷冻保存的离体茎尖取出，投入卸载液中解冻并洗涤，然后将茎尖接种于恢复再生培养基中，在25±2℃下暗培养7d，最后移至光下培养；

所述卸载液的组成为：MS+1.2mol/L蔗糖；所述恢复再生培养基的组成为：MS+0.5mg/L BA+30g/L蔗糖+9.0g/L琼脂。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，洗涤次数为2~3次，每10min更换一次卸载液。