[发明专利]一种超分辨显微方法和装置

说明书

技术领域

本发明属于超分辨领域，尤其涉及一种能在远场实现超衍射极限的分辨率的超分辨显微方法和装置。

背景技术

由于光学系统衍射的影响，常规远场光学显微方法可实现的分辨率存在限制。根据阿贝衍射极限理论，光束经显微物镜聚焦后所成光斑的尺寸用半高全宽表示为其中λ为显微镜的工作波长，NA为所用显微物镜的数值孔径。因此，常规远场光学显微镜的极限分辨率一般被限制在了半波长左右。

近年来，为了突破光学衍射极限的限制，提高显微系统的分辨率，科研工作者们提出了多种超分辨光学显微方法。

例如：受激发射损耗显微术(STED：Stimulated Emission Depletion Microscopy)，即利用荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系，并通过限制受激辐射衰减的区域，减少荧光光斑大小，获得小于衍射极限的发光点来提高系统分辨率，从而突破远场光学显微术的衍射极限分辨力限制来实现无接触三维成像；结构光照明荧光显微术(SIM：Structured Illumination Microscopy)；随机光场重建显微术(STORM：Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)等。

上述几种方法均可以在远场实现荧光超分辨显微，在实际测试中也得到了相应的应用，但是都还仍然存在着不足。其中，STED显微术的分辨率由所加损耗光的光功率决定，因此当实现高分辨率时，其所要求的光功率很强，容易导致荧光分子的漂白。此外，STED显微术的系统较为复杂，造价一般比较昂贵。SIM显微术对光功率的要求虽然不高，但是由于其需要光栅扫描，成像速度较慢，成像系统也较为复杂。STORM显微术的成像速度也很慢，目前还很难运用于活体细胞的实时检测当中。

发明内容

本发明提供了一种超分辨显微方法和装置，可以在远场实现超衍射极限的分辨率。该种方法和装置具有成像速度快、装置简单、分辨率高等特点，可以很好地应用于荧光及非荧光样品的检测之中。

一种超分辨显微方法，包括以下步骤：

1)将激光器发出的激光光束准直后转换为线偏振光；

2)对所述线偏振光进行相位调制，调制函数为其中，ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角；

3)将所述相位调制后的线偏振光进行光路偏转；

4)偏转后的光束经聚焦和准直后转换为圆偏振光投射到待测样品上，以实现对待测样品的二维扫描；

5)在二维扫描过程中收集所述待测样品各扫描点发出的信号光，滤去杂散光得到第一信号光强I₁(x，y)，其中x，y为扫描点的二维坐标；

6)将步骤2)中的调制函数切换为ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角；

7)重复步骤3)和步骤4)，对步骤5)中的各扫描点进行第二次扫描，收集得到的第二信号光强I₂(x，y)；

8)根据公式I(x，y)＝I₁(x，y)-γI₂(x，y)计算有效信号光强I(x，y)，并利用I(x，y)得到超分辨图像，其中，为第一信号光强I₁(x，y)中的最大值，为第二信号光强I₂(x，y)中的最大值。

当待测样品为荧光样品时，所述信号光为所述圆偏振光经显微物镜投射后在样品上激发出的荧光；当待测样品为非荧光样品时，所述信号光为所述圆偏振光经显微物镜投射后经样品表面的反射光束。

待测样品上的x，y轴方向由二维扫描方向决定。

所述有效信号光强值I(x，y)为负时，设置I(x，y)＝0。

本发明提供了一种超分辨显微装置，包括光源、承载待测样品的样品台和将光线投射到所述样品台的显微物镜，所述光源与显微物镜之间依次设有：

用于将所述光源发出的光束改变为线偏振光的起偏器；

用于对所述线偏振光进行相位调制的空间光调制器；

用于对所述相位调制后的光束进行光路偏转的扫描振镜系统；

依次布置的分别用于对所述扫描振镜系统出射的光束进行聚焦和准直的扫描透镜和场镜；

用于将准直后的光束转换为圆偏振光的1/4波片，所述圆偏振光通过所述显微物镜投射到所述待测样品上；

并设有用于控制所述空间光调制器和扫描振镜系统的控制器及收集所述待测样品发出的信号光的探测系统。

探测系统包括：