[发明专利]三孢布拉氏霉菌异戊二烯焦磷酸异构酶序列及用途

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域。特别涉及来源于三孢布拉氏霉菌的异戊二烯焦磷酸异构酶基因、其编码蛋白及其在产类胡萝卜素的大肠杆菌基因工程菌中的应用。

技术背景

在生物代谢途径中，异戊二烯焦磷酸异构酶（IPI，EC 5.3.3.2）催化异戊二烯焦磷酸（IDP）转变为二甲基丙烯焦磷酸酯（DMAPP）。IDP和DMAPP经酶促反应缩合为法呢基焦磷酸（FPS）。FPS是类胡萝卜素、人参皂苷、薄荷醇和甘草素等许多具有保健和药用价值的天然产物的共同前体。研究表明，IPI是上述途径的关键代谢酶。因此，克隆和研究IPI的编码基因，对使用基因工程法生产上述天然产物具有重要意义。

类胡萝卜素具有抗氧化、抗癌和调节免疫系统等重要功能，而人体不能自行合成类胡萝卜素，必须通过饮食摄入。与化学合成和直接提取法相比，发酵法生产的类胡萝卜素具有安全无毒和成本低廉等优势。接合菌三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）在生长过程中可以积累大量β-胡萝卜素，是目前唯一用于商业生产番茄红素和β-胡萝卜素的真菌。本发明克隆了三孢布拉氏霉菌的异戊二烯焦磷酸异构酶基因ipi的全长cDNA序列，为利用基因工程发酵生产类胡萝卜素等高附加值萜烯类物质提供了新的基因来源。

发明内容

本发明提供了一个异戊二烯焦磷酸异构酶基因的全长cDNA序列，将其克隆至产β-胡萝卜素的基因工程大肠杆菌中，可以显著提高β-胡萝卜素的产量。

生三孢布拉氏霉菌异戊二烯焦磷酸异构酶的氨基酸序列，所述氨基酸序列如序列表1所示。

生三孢布拉氏霉菌异戊二烯焦磷酸异构酶cDNA序列，包括5′非翻译区、编码区、3′非翻译区和多聚腺苷酸尾巴，所述cDNA的序列如序列表2所示。

所述的cDNA序列，该cDNA序列可以用于构建表达三孢布拉氏霉菌异戊二烯焦磷酸异构酶的大肠杆菌表达载体。

所述的cDNA序列，该cDNA序列可以用于增强产类胡萝卜素的基因工程大肠杆菌的β-胡萝卜素产量。

本发明利用基因库中已有的三孢布拉氏霉菌ATCC 14272（-）异戊二烯焦磷酸异构酶基因ipi的EST序列（GenBank收录号JK017326），分别进行5′和3′末端快速扩增。将所得序列测序后拼接，获得了含有743bp的三孢布拉氏霉菌异戊二烯焦磷酸异构酶基因的全长cDNA序列。该cDNA序列含有624bp的编码区，26bp的5′非翻译区，71bp的3′非翻译区，以及一个22bp的多聚腺苷酸尾巴。该cDNA编码一个207个氨基酸的蛋白，该蛋白的等电点为5.46，分子量为24.1kDa。

将本发明所克隆的ipi基因cDNA编码区连接至pET22b表达载体，转入带有胡萝卜素合成酶质粒pACCAR16ΔcrtX的大肠杆菌中。发酵培养48小时后，提取β-胡萝卜素，使用高效液相色谱测定β-胡萝卜素含量。结果表明，ipi的转入使得β-胡萝卜素提高46.7%。本发明为基因工程法生产甲羟戊酸途径下游的次生代谢产物提供了新的基因来源。

附图说明

图1不同物种异戊二烯焦磷酸异构酶的进化树分析。蛋白编号来自www.uniprot.org。

图2三孢布拉氏霉菌异戊二烯焦磷酸异构酶基因ipi在大肠杆菌中的表达。M为蛋白分子量Marker；1泳道为对照用品；2泳道为表达ipi的样品。

图3三孢布拉氏霉菌异戊二烯焦磷酸异构酶基因ipi在产类胡萝卜素的大肠杆菌中表达。

图4高效液相色谱测定表达和不表达三孢布拉氏霉菌异戊二烯焦磷酸异构酶基因ipi的基因工程大肠杆菌中的类胡萝卜素含量。

具体实施方式

1三孢布拉氏霉菌异戊二烯焦磷酸异构酶基因ipi的克隆