[发明专利]一种b型流感嗜血杆菌发酵液的细菌荚膜染色方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细菌染色方法，具体涉及一种b型流感嗜血杆菌发酵液的细菌荚膜染色方法。

背景技术

流感嗜血杆菌（学名Haemophilus influenzae），简称嗜血杆菌，前称费佛氏杆菌（或译拜菲尔氏菌）或流感杆菌，属孤菌科嗜血杆菌属，是一种没有运动力的革兰氏阴性杆菌。

流感嗜血杆菌分类为荚膜菌株和无荚膜菌株两类。其中，荚膜类的乙型流感嗜血杆菌，即b型流感嗜血杆菌（简称Hib）是毒性的主因之一。为预防由流感嗜血杆菌引起的侵袭性感染，现今常采用纯化的Hib荚膜多糖与破伤风类毒素蛋白共价结合制成的b型流感嗜血杆菌结合疫苗对其进行预防。

Hib结合型疫苗的生产过程包括菌种传代培养、罐培养、多糖提取、纯化、衍生和结合等步骤。罐培养后Hib荚膜含量对荚膜多糖的产量有着直接的影响，因此对罐培养发酵液中Hib荚膜进行染色观察可以在一定程度上判断Hib荚膜多糖的产量，为发酵工艺的改进提供一定的指标，对发酵工艺条件的改良优化具有指导意义。

常用的细菌荚膜染色方法有赫(Hiss)氏染色法、墨汁染色法、Tyler法等。

赫(Hiss)氏染色法的操作过程如下：

按常规方法涂片后在空气中自然干燥，然后用乙醇固定，滴加适量5ml结晶紫乙醇饱和溶液与95ml水的混合液后，加微热至发生蒸气，染色1min，最后使用200g/L硫酸铜水溶液将涂片上的染液洗去。观察结果，菌体及背景呈紫色，荚膜为鲜蓝色。

墨汁染色法的操作过程如下：

按常规方法涂片，在载玻片上滴1滴印度墨水或5%黑色素水溶液，加上盖玻片，轻轻压一下，使标本混合液变薄后即可镜检。观察结果，菌体及背景呈黑色，荚膜无色。

Tyler法的操作过程如下：

按按常规方法涂片后在空气中自然干燥，用20%CuSO4水溶液洗去结晶紫，用吸水纸吸干水分后，立即加1～2滴香柏油于涂片处，以防止CuSO4结晶的形成。取另一块干净的盖玻片与载玻片成45度角将混合物由左侧刮至右侧，并在空气中干燥。结果，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色。

上述方法以及其他的一些方法都存在一定的缺点。首先，操作过程比较复杂，对实验员的操作技能要求较高，容导致实验失败；对染色剂的稳定性要求也较高，若选用大颗粒染色剂，往往会影响观察的结果；此外，这些方法染色后往往只能看到少数的几个菌体，且需要在显微镜下大范围查找，对于实际操作很不方便。而且由于细菌荚膜含水量高，加热会使菌体失水收缩，与细胞周围染料脱离而产生透明的明亮区，导致某些无荚膜的菌体被误认为有荚膜的菌体。

发明内容

本发明的目的即在于克服现有技术的不足，提供一种操作简单，染色效果好，结果清晰容易辨认的b型流感嗜血杆菌发酵液的细菌荚膜染色方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种b型流感嗜血杆菌发酵液的细菌荚膜染色方法，它包括以下步骤：

A．预处理：取b型流感嗜血杆菌发酵液1ml，置冰浴中冷却0.5~1.5min；

B．制片：用0～20μL移液枪取预处理后的b型流感嗜血杆菌发酵液4~6μL滴于载玻片左上角，并取4~6μL绘图墨水滴于载玻片左下角，使b型流感嗜血杆菌发酵液与绘图墨水混合均匀；

C．涂片：取干净的盖玻片，与并使之与载玻片成45°角，然后将混合物由左侧刮至右侧；

D．干燥：将载玻片放置于空气中自然晾干；

E．染色：干燥后，在载玻片上滴浓度为0.5%沙黄溶液1～3滴，固定1.5~2.5min后用水将涂片上的沙黄溶液洗去；

F．二次干燥：用吸水纸吸干载玻片周围的水分，然后将载玻片晾干；

G．镜检：将二次干燥后的载玻片置于油镜下观察，观察到的菌体与背景为明亮的淡红色，荚膜无色。

本发明的优点在于：

1．操作过程简单，对实验员的操作技能要求不高，实验成功率高；

2．染色效果好，荚膜与背景颜色对比明显，容易观察；

3．采用负染色原理，保证了细菌荚膜的完整性，菌体范围大，容易辨认；

4．b型流感嗜血杆菌发酵液经冷却处理，可以准确地观察有荚膜的菌体数量。

附图说明

图1为实施例1的b型流感嗜血杆菌荚膜染色后的观察图；

图2为实施例2的b型流感嗜血杆菌荚膜染色后的观察图；

图3为实施例3的b型流感嗜血杆菌荚膜染色后的观察图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，本发明的保护范围不限于以下所述。