[发明专利]一种同时测定四逆剂植物药血浆中5种生物碱的方法

说明书

技术领域

本发明属药物代谢动力学领域，特别是涉及四逆剂植物药中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱在哺乳动物血浆中的测定方法。 

背景技术

四逆汤由附子、干姜、炙甘草等药物组成，在保护心肌、改善心功能、防止缺血-再灌注的损伤等方面均具有较好的防治作用，但对四逆汤植物药缺乏药物代谢动力学的研究，难以为质量控制、剂型设计、临床合理用药提供依据。 

四逆汤中的药效成分主要为附子中的生物碱类成分。附子中生物碱类成分主要可以分为双脂型生物碱、单脂型生物碱和胺基醇类生物碱。其中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等为双脂型二萜类生物碱，单脂型生物碱如苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱是双脂型生物碱的水解产物，其毒性仅约为乌头碱的千分之一，进一步水解为胺基醇类生物碱毒性更低，但其药效却未有明显降低[陈信义,李峨,侯丽,等[J].乌头类生物碱研究进展与应用前景评述[J].中国中医药信息杂志2004,11(10):922-923]。 

到目前为止，文献仅有对血浆样品中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等双脂型二萜类生物碱的测定方法[何雷萍,狄斌,杜迎翔,等. 4种附子配伍方给药后大鼠血浆中3个乌头类生物碱的药动学比较[J].中国药科大学学报, 2010,41(1): 55- 59；沈红,朱玲英,姚楠,等. 甘草与附子配伍对乌头碱 新乌头碱、次乌头碱大鼠药动学的影响[J].中药材,2011,34(6):937-942]，尚未见四逆剂植物药血浆样品中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱的同时测定方法。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供四逆剂植物药中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱的同时测定方法，该方法用于药代动力学研究，阐明四逆剂植物药中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱的药代动力学规律。 

（1）哺乳类血浆样品预处理 

取哺乳类动物给予四逆剂植物药的含药血浆100μL，加入草乌甲素（内标）10 μL（10 ng·mL^-1），氨水10 μL碱化，涡旋30s，按照1:4- 1:10体积比加入乙酸乙酯，涡漩3-5 min，离心10 min（4000-10000 r·min^-1），取上清液，下层液再用1:4体积比乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯层，氮气吹干，残渣用流动相100 μL溶解。 

（2）HPLC-MS-MS测定 

色谱条件：色谱柱：CAPCELL PAK C₁₈（100 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：A相为乙腈-0.1%冰醋酸（1:99，v/v），B相为乙腈-水（99:1, v/v）；质谱条件：电喷雾离子源（ESI），采用正离子模式检测，检测离子：乌头碱[M+H]+，m/z 646.3→586.3，dp：120V，CE：47V；新乌头碱[M+H]+，m/z 632.3→572.3，642.3→640.3，dp：120V，CE：45V；次乌头碱[M+H]+，m/z 616.3→556.3，616.3→524.3，dp：120V，CE：47V；苯甲酰新乌头原碱M+H]+，m/z 590.3→558.3，590.3→540.3，dp：120V，CE：47V；苯甲酰乌头原碱M+H]+，m/z 604.3→554.3，604.3→572.3，dp：120V，CE：50V。

所述四逆剂包括附子干姜汤、四逆汤及其制剂；所述步骤（1）采用草乌甲素为内标物；所述步骤（2）采用正离子模式检测。 

本发明在液液萃取中，被检测组分在不相混溶的两种溶剂中分配，选择合适的有机溶剂及合适的比例，可使溶于血浆中的非极性组分提取进入有机相，再将有机相用氮气吹干富集。利用HPLC法将被检测组分与其他化学成分分离，最后联用MS检测器进行检测。 

本发明采用草乌甲素作为内标，使分析方法更加灵敏、准确，有利于四逆汤植物药中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱的同时测定。 

附图说明

图1 四逆汤植物药中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱HPLC-MS-MS色谱图。 

具体实施方式