[发明专利]一种广谱β-内酰胺酶荧光底物及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种广谱β-内酰胺酶荧光底物，其特征在于：所述广谱β-内酰胺酶荧光底物的具体结构式如下所示的化合物或所述化合物的对映体、消旋体或非对映异构体:

2.一种制备权利要求1所述广谱β-内酰胺酶荧光底物的方法，其特征在于，包括如下具体步骤A～E、B～E、C～E或D～E，具体化学反应式如下所示：

3.根据权利要求2所述的制备广谱β-内酰胺酶荧光底物的方法，其特征在于：

步骤A操作为：以头孢噻肟钠为原料在酸性条件下溶解，加入二苯基重氮甲烷，调节pH值到9后，萃取提取；洗涤有机层，干燥，除去溶剂；经硅胶柱分离纯化，收集组分除去溶剂后得到化合物1；

步骤B操作为：将2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基咪唑六氟磷酸盐、1-羟基-苯并三唑、二异丙基乙胺、加入化合物1和三苯甲基甘氨酸混合溶解，搅拌，反应完成后，将反应液提取，洗涤有机层浓缩后，经硅胶柱分离纯化，收集组分除去溶剂后得到化合物2；

步骤C操作为：三异丙基硅烷和三氟乙酸加入到含有化合物2的二氯甲烷溶液中，搅拌，除去溶剂后洗涤，然后溶解在乙腈和磷酸钠缓冲液中，加入从新鲜桔皮中提取的乙酰酯酶后，混合物搅拌，除去乙酰酯酶，滤液浓缩，调pH值至3.5左右，缓慢加入Ph₂CN₂和乙腈，搅拌，调整pH值至8.9，用乙酸乙酯提取两次，有机层加入三苯甲基甘氨酸的羟基琥珀酼亚胺脂，并用高效液相色谱法来监测反应进程，反应完成后，混合物用盐水洗涤三次后，浓缩除去溶剂后重新溶解于二氯甲烷中，继续加入4-硝基苯基氯和吡啶，搅拌，反应结束后，经硅胶柱分离纯化，收集组分除去溶剂后得到化合物3；

步骤D操作为：化合物4溶解于含有二异丙基乙胺的二甲基甲酰胺中，然后加入化合物3，混合物在0°C下搅拌用胶柱纯化分离洗脱，得到化合物5；

步骤E操作为：三异丙基硅烷和三氟乙酸加入到含化合物4的正己烷中，搅拌，除去溶剂，用二氯甲烷洗涤3次后重新溶解在二甲基亚砜中，然后加入化合物6和二异丙基乙胺，搅拌，反应结束后，通过制备高效液相色谱纯化，用岛津高效液相色谱法在540nm波长检测，收集组分得到化合物7，即所述的β-内酰胺酶荧光底物。

4.根据权利要求3所述的制备广谱β-内酰胺酶荧光底物的方法，其特征在于，所述步骤A具体反应为：以头孢噻肟钠为原料加入1毫摩尔的盐酸和甲苯磺酸溶解在乙腈和水溶液中，加入二苯基重氮甲烷，在0°C下混合搅拌直到特征的紫色消失；在混合物中加入氢氧化钠溶液调节pH值到9后，用乙酸乙酯萃取提取；有机层先后用水和饱和盐水洗涤，干燥，在用旋转蒸发仪除去溶剂；富集物用30％正己烷-乙酸乙酯在50克的硅胶柱上进行分离纯化，收集组分干燥。

5.根据权利要求3所述的制备广谱β-内酰胺酶荧光底物的方法，其特征在于，所述步骤B具体反应为：在乙腈溶液中添加2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基咪唑六氟磷酸盐，1-羟基-苯并三唑和二异丙基乙胺，然后在-20°C下加入化合物1和三苯甲基甘氨酸，混合物在-20°C下搅拌，然后自然升温到0°C，并继续反应，反应完成后，将反应液倒入含冰水和2M HCl的混合液中，用100毫升的二氯甲烷提取，有机层用饱和盐水洗两次，干燥，然后旋转蒸发浓缩得到淡黄色固体，所述淡黄色固体经硅胶柱以15％乙酸乙酯-正己烷洗脱纯化，收集组分用干燥。