[发明专利]玉米淹水胁迫响应zmERF2基因启动子的克隆及其应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种绵玉米淹水胁迫响应zmERF2基因启动子的克隆及其应用。

背景技术

我国每年受洪涝灾害的农田面积平均为956万公顷，其中严重的年份，受灾面积达1500万公顷以上。在亚洲地区，洪涝灾害给玉米的生产造成了很大的损失，仅南亚，每年超过15％的玉米种植面积遭受不同程度的危害。在印度，洪涝灾害造成玉米每年减产25-30％。我国南方春玉米和北方夏玉米在正常的栽培季节中，经常遭受洪涝和渍害，玉米根系长期处于低氧状态，导致玉米减产10％-40％。涝渍害已成为我国南方玉米高产、稳产的主要制约因子之一。因此，克隆玉米淹水胁迫响应基因及其启动子，对阐明玉米淹水胁迫响应形成的分子机理以及玉米和其他旱生作物耐涝渍的遗传改良，具有十分重要的理论价值和实践意义。

ERF基因是参与植物非生物胁迫响应的关键基因之一，是水稻、深水稻和拟南芥淹水胁迫响应的关键基因。因此，克隆玉米ERF基因的启动子，有助于阐明玉米耐渍性形成的分子机制，同时为玉米及其他旱生作物的耐渍遗传改良提供理论指导。然而，玉米ERF启动子的克隆，目前，尚未见有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种绵玉米淹水胁迫响应zmERF2基因启动子的克隆及其应用，含有1个ARE、1个GARE、1个GC motif、2个Skn-1motif、1个CGTCA-motif和1个MBS位点顺式元件，这些顺式元件与植物激素、厌氧胁迫响应相关；是一个组织特异型的启动子，只在根系中表达；是一个诱导型的启动子，受淹水诱导高效表达。该启动子与抗虫、抗病、抗逆等目的基因连接，在淹水、涝渍条件下，可提高转基因植株根部的抗虫、抗病、抗逆境能力。同时该启动子只在根部表达，不涉及食用转基因植物地上部分的食品安全问题。zmERF2启动子在旱生植物的耐渍遗传改良中，具有很好的应用前景。

其技术方案如下：

1、玉米zmERF2基因的获得

根据已知的玉米基因组信息，使用烟草ERF2蛋白的AP2/ERF结构域高度保守的蛋白质序列，进行同源比对分析，电子克隆出121个ERF基因。通过与拟南芥、水稻、烟草等其他植物ERF基因的比较分析，剔除48个假阳性，获得了73个ERF基因，分别命名为zmERF1--zmERF73。玉米自交系Hz32的耐渍性较强，而Mo17耐渍性较弱，在玉米3叶1心期，分别对Hz32和Mo17进行0、4、12h的淹水处理，并利用real-time PCR对73个ERF基因在各处理根系的表达进行了分析，结果发现zmERF2基因在Hz32根系受淹水诱导高效表达，而在Mo17中表达量低，结果暗示zmERF2基因的启动子是淹水胁迫响应的诱导型启动子。

2、玉米自交系Hz32叶片总DNA的提取

取玉米叶片5.0g于液氮中研磨，转入50ml离心管中。加预热至95℃的CTAB缓冲液(1.17MNaCL、0.0016M EDTA-8.0，0.835M Ttis-7.5，1.6％CTAB，1％β-疏基乙醇)10ml，混匀。在65℃水浴锅内反应90分钟，不时轻摇离心管。取出离心管，待冷至室温后，加入等体积氯仿∶异醇(24∶1)，小心摇动试管10分钟。8000rpm离心10分钟，将上清转至另一50ml离心管中。加2/3体积异丙醇，小心混匀，将棉絮状DNA转入盛10ml70％乙醇的50ml离心管中，浸泡12小时。倒掉70％乙醇，将DNA晾干，加入1ml TE溶解。待DNA完全溶解后，转入2.0ml离心管中，加入10μl10mg/ml RNaseA，混匀；在37℃下，温育2小时。再用1ml苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，8000rpm离心10分钟。将上清液转入2.0ml离心管中，加入1/10体积的3M NaAC(PH5.2)，2/3体积异丙醇沉淀DNA。将棉絮状DNA转入2.0ml离心管中，用70％乙醇洗涤一次，短暂离心，使DNA贴壁，倒去70％乙醇，晾干DNA。待DNA晾干后，加入0.5ml T.E溶液，完全溶解DNA，于-20℃长期保存。

3、zmERF2基因启动子的克隆