[发明专利]一种橡胶树多酚氧化酶、其编码基因及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种橡胶树多酚氧化酶、其编码基因及应用。

背景技术

多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase, PPO)是一类广泛分布于动物、植物、真菌和细菌中的含铜氧化还原酶。在O₂存在下，PPO可催化单酚羟基化为邻二酚，二羟酚氧化为邻醌。广义的PPO包含漆酶(laccase, EC.1.10.3.1)、酪氨酸酶(tyrosinase, 或单酚氧化酶, monophenolase, EC.1.14.18.1)和儿茶酚氧化酶(catechol oxidse, 或双酚氧化酶, o-diphenoloxidase, EC.1.10.3.2)。一般所说的PPO是指儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。

儿茶酚氧化酶是植物中主要存在的PPO，它由核基因编码，大多植物中以多个基因家族形式存在。PPO通常以无活性的前体形式存在，该前体一般由N-端导肽(transit peptide)、中间高度保守的Cu结合区及C-端疏水区组成。导肽具有叶绿体定位蛋白的典型特征，它可引导PPO前体蛋白定位到叶绿体的类囊体和其它类型质体的基质中。Cu结合区是功能区，该区域6-7个高度保守的组氨酸(His)和1个半胱氨酸(Cys)残基对于其酶活性是必需的。晶体结构显示，两组His残基(每组3-4个)分别可与一个Cu以配位键形式相连，从而形成具有特定三维结构(Type-3 copper bridged)的活性部位。疏水性的C-端只在前体中存在，常由几个β-链形成反向平行的β-折叠，它可与Cu结合，可能与PPO三维结构的形成及酶活性有关。

PPO基因的表达特性比较复杂，不同家族成员在不同组织、不同发育时期及不同环境条件下呈现出不同表达模式，并且不同成员的底物特异性明显不同。PPO基因可被机械损伤、病原物侵染、植食性昆虫取食为害、虫害诱导挥发物及茉莉酸、水杨酸等防御反应信号分子处理诱导。除参与植物病原物侵染及虫害等防御反应外，PPO是水果、蔬菜等农产品发生有害褐变的主要原因。

天然橡胶(顺-1,4-聚异戊二烯)是一种重要的工业原料，其主要来源为巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell. Arg.)。橡胶树中，除胶乳中存在PPO外(Coupé M, Pujarniscle S, d’Auzac J. Compartimentation de diverses oxydo-réductases (peroxydase, o-diphenol-oxydase et malate déshydrogénase) dans le latex d’Hevea brasiliensis (Kunth). Müll Arg Physiologie Végétale, 1972, 10: 459–464; Wititsuwannakul D, Chareonthiphakorn N, Pace M, Wititsuwannakul R. Polyphenol oxidases from latex of Hevea brasiliensis: purification and characterization. Phytochemistry, 2002, 61(2): 115-121)，橡胶树的芽、叶片、种子和悬浮细胞均具有PPO活性。据最近的报道，橡胶树的愈伤和悬浮细胞中存在2种PPO蛋白(这里我们将其命名为HbPPO1和HbPPO2)，其中HbPPO1受损伤抑制，而HbPPO2则为损伤所诱导，这表明HbPPO2可能了参与橡胶树的防御反应，同时也可能是造成橡胶树组培外植体褐化的主要原因。深入研究发现，HbPPO2的分子量约为70 kDa，酸性蛋白，最优底物为儿茶酚(Muhamad N, Chirapongsatonkul N, Churngchow N. Defense-Related Polyphenol Oxidase from Hevea brasiliensis Cell Suspension: Purification and Characterization. Appl Biochem Biotechnol, 2012, 167(1): 177-189)。虽然如此，然而至今还未见有关该酶编码基因及其蛋白序列的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种受损伤诱导的橡胶树多酚氧化酶、其编码基因及应用。