[发明专利]一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列及方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列及方法。

背景技术

抗生素是20世纪最重要的医学发现之一，长期以来，抗生素在医疗领域的广泛应用，对控制人类感染性疾病发挥了巨大的作用。同时，由于兽药抗生素能够预防动物疾病和一定程度上促进生长的双重功效，因此，常以亚治疗剂量长期添加于动物饲料中，出现在养殖业和畜牧业中。由于抗生素在畜牧业和养殖业中的长期滥用，在养殖动物肠道内诱导出抗性菌株，这些编码抗生素抗性基因的菌株是环境中抗生素抗性基因最重要的来源，携带抗性基因的抗性细菌如果在全球传播，可能导致大范围的对环境生物、人类健康和社会经济的潜在不利影响。环境中的抗生素抗性基因的污染越来越被人们视为一种生态性问题。

相关研究表明，污水处理厂因为进水中包含重金属、抗生素、洗涤剂、季铵盐等物质，这些物质也可以协同或交叉引起微生物抗药性，且污水处理厂微生物分布密集，极易诱导微生物产生抗性基因；而污水处理厂出水被认为是受纳水体中抗生素抗性基因的主要来源。并且也有相关研究指出，污水处理厂污泥中可以检出多种四环素类抗性基因，抗性基因不仅种类丰富，相对含量也较高。

近些年来，我国污水处理工作也在高速发展中，污水处理厂在解决我国水污染问题方面起到了巨大的作用，然而，污水处理厂的高速发展，产生的污泥问题也日益突出，因此对于污泥中抗性基因进行精确定量意义重大。

近年来有许多关于微生物对四环素和其他类抗生素表型抗性的研究，然而目前研究所采用的方法只能研究可培养微生物的抗性，而对不可培养微生物的抗性及微生物体内导致这些抗性的特定基因无法检测。因此近年来越来越多的研究采用实时荧光定量PCR(Real-time quantitive PCR)技术作为研究手段，从数量上更为直观地探讨环境中抗性基因的变化，而且由于这种方法不依赖于微生物培养，因此也能检测不可培养微生物所携带的抗性基因，使最终得到的量化结果更为全面和可信。

目前国外对环境中四环素抗性基因的定量研究主要集中于水环境，国内关于环境中抗生素抗性基因的研究才刚刚起步，而污水处理厂经常被认为是抗性基因的重要储存库，因此对于污泥中四环素类抗药基因为精确定量是十分必要的。

发明内容

本发明提供了一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列及方法，能对城市污水处理厂污泥中四环素类抗药基因tetG进行快速精确定量。

一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列，包括正向引物和反向引物，其碱基序列为：

正向引物：TTATCGCCGCCGCCCTTCT；

反向引物：TCATCCAGCCGTAACAGAAC。

本发明还提供了一种利用所述的引物序列检测污泥中四环素类抗性基因tetG的方法，包括：

(1)提取待测污泥样品中的DNA，以提取的DNA为模板，用所述的正向引物和反向引物进行定量PCR扩增并记录达到荧光阈值时的循环数；

(2)将步骤(1)中得到的循环数参照定量PCR测定目的基因tetG质粒标准品的标准曲线，得到待测污泥样品中四环素类抗性基因tetG的含量。

所述定量PCR的反应体系为：2ul DNA溶液，7.5ul SYBR Premix ExTaq溶液，0.3ul ROX Reference溶液，0.3ul浓度为10mM的正向引物，0.3ul浓度为10mM的反向引物，4.6ul ddH₂O。

步骤(2)中所述标准曲线的标准品的制备方法为：利用所述的正向引物和反向引物做普通PCR扩增；扩增序列用商业化凝胶回收试剂盒纯化；纯化后测量DNA含量、纯度并调节至合适浓度；接入载体并转化入感受态细胞；将感受态细胞涂于含有氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB固体培养基上培养12-16h，通过蓝白斑筛选挑取白色重组菌斑，挑选白色阳性克隆子用LB培养液扩大培养；待菌液混浊后，取1ml菌液送公司测序插入的基因片断，其余3-4ml菌液用来提取质粒；使用微量核酸蛋白质分析仪检测提取质粒的含量及纯度，确保质粒DNA的A260/A280比值在1.8左右，符合要求的质粒作为标准品绘制标准曲线。