[发明专利]等温扩增检测猴痘病毒的试剂及等温扩增检测猴痘病毒的方法

权利要求书

1.一种等温扩增检测猴痘病毒的试剂，其特征在于，它包括：

（1）检测猴痘病毒的标准品，所述标准品为采用人工合成的基因片段，克隆入pGSI质粒，得到的重组质粒载体；所述基因片段的碱基序列如SEQ ID NO：1所示；

（2）引物，其基因碱基序列：

外引物F3：5′-CATTGATTTTTCGCGGGATA-3′；

外引物B3：5′-TCCATCTCCTCCAGAATCTCC-3′；

内引物FIP：

5′-GTTGGTCTACGACAATGGATGCTCATCAGAATCTGTAGGCCGTGT-3′；

内引物BIP：

5′-TCCTTAGTCCAATGTTTTTAATAACCGAAAAATTTCTACGATCTATATTGACGAG-3′。

2.一种等温扩增检测猴痘病毒的方法，其特征在于：

它的反应体系25μl，包括10×buffer2.5μl，引物混合物1μl，模板DNA1μl，8U BstDNA聚合酶0.8μl，甜菜碱（8M）2μl，dNTP(10mM)2μl，MgSO₄(100mM)1.2μl，1.25μl荧光染料20×Eva Green，加入ddH₂O补足25μl；反应体系中引物终浓度分别如下：外引物F3和外引物B3各40pM，内引物FIP和内引物BIP各800pM；

将上述反应体系在水浴箱上63℃90分钟，或者在荧光定量PCR仪上63℃1分钟，90个循环，同时进行待测样本、阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用双蒸水，阳性对照采用权利要求1所述的检测猴痘病毒的标准品；

反应结束后，取扩增产物观察电泳结果，阳性对照孔产生阶梯状的条带，阴性对照孔则没有条带产生，待测样本孔中如产生阶梯状条带则含有猴痘病毒，反之没有猴痘病毒；或者，反应结束后，反应管离心6000rpm，3分钟，观察结果，阳性对照管可见白色沉淀，阴性对照管没有产生沉淀，样本管中如产生白色沉淀则含有猴痘病毒，反之没有猴痘病毒；或者紫外灯下观察荧光强度的变化，阳性对照产生强烈绿色荧光，阴性对照荧光强度没有变化，样本管中如产生强烈绿色荧光则含有猴痘病毒，反之没有猴痘病毒。

3.如权利要求2所述的一种等温扩增检测猴痘病毒方法，其特征在于：

待测样本被检测出阳性后，所述方法通过对比标准曲线来对待测样本进行猴痘病毒的浓度检测；所述浓度检测包括以下步骤：

将待测样本和稀释至不同浓度的权利要求1所述的检测猴痘病毒的标准品同时按权利要求2所述的反应体系，在荧光定量PCR仪上进行扩增，反应程序63℃1分钟，90个循环，读取荧光值，阴性对照采用灭菌双蒸水，反应结束后根据得到所述标准品的各个浓度的循环阈值C（t），采用计算机自动绘制标准曲线；

通过对比标准曲线来对待测样本进行猴痘病毒的浓度检测，将待测样本循环阈值C（t）与所述标准曲线对照，得到待测样本DNA中的靶基因片段拷贝浓度，按照所述拷贝浓度判断待测样本中猴痘病毒的浓度。