[发明专利]酸土环脂芽孢杆菌检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测试剂盒，尤其是涉及一种采用环介导等温扩增技术的酸土环脂芽孢杆菌检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

酸土环脂芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）是一种嗜热、嗜酸、好氧的杆菌，是耐热菌（thermo-acidophilic bacteria，TAB）中污染果汁的主要菌种，其芽孢能经受酸性果汁加工中的巴氏杀菌而存活，在适宜的温度下可大量繁殖，引起果汁感官品质劣变，耐热菌超标是浓缩果汁产品最为严重的质量问题之一（胡贻椿，岳出利，袁亚宏等.果汁中脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus spp．）的危害及其控制[J]．食品科学，2008，29(1)：364-368）。近年来，我国浓缩苹果汁行业取得了突飞猛进的进步，2010年我国已经成为世界苹果浓缩汁的生产出口第一大国。2011年1～11月我国出口浓缩苹果汁数量为54.13万吨，金额为9.36亿美元（http://www.21food.cn/html/news/35/666252.htm（食品商务网））。目前，国际贸易中对果汁中耐热菌有严格要求，是苹果浓缩汁的必检项目，也是当前中国苹果浓缩汁出口中所遭遇的主要技术壁垒之一和苹果浓缩汁生产中急待解决的问题。目前，检测酸土环脂芽孢杆菌的方法主要有传统的微生物生理生化检测法和分子生物学的PCR法（孔德义，董佳，白小琼.脂环酸芽孢杆菌的研究进展[J]．粮食与食品工业，2011，18（2）：39-42），尚未见到用环介导等温扩增扩增技术检测酸土环脂芽孢杆菌的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、特异性强且成本低的酸土环脂芽孢杆菌检测试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种检测酸土环脂芽孢杆菌的方法。

所述酸土环脂芽孢杆菌检测试剂盒包括：

1）环介导等温扩增反应液；

所述环介导等温扩增反应液含有10×Thermopol反应缓冲液、10mmol/L dNTP、50mmol/L硫酸镁、20μmol/L酸土环脂芽孢杆菌上游内引物、20μmol/L酸土环脂芽孢杆菌下游内引物、20μmol/L酸土环脂芽孢杆菌上游外引物、20μmol/L酸土环脂芽孢杆菌下游外引物；

酸土环脂芽孢杆菌上游外引物F3：

CGGGTAGGCATCTACTTGTG；

酸土环脂芽孢杆菌下游外引物B3：

GCGGAAGATTCCCTACTGC；

酸土环脂芽孢杆菌上游内引物FIP：

GCCGTTACCTCACCAACTAGCTGAAAGATGCAACTGCATCGC；

酸土环脂芽孢杆菌下游内引物BIP：

GATGCGTAGCCGACCTGAGAGTGCCTCCCGTAGGAGTCT；

2）Bst DNA聚合酶：含8个活性单位（U）/μl；

3）显色剂：SYBR GREEN I荧光染料，1000×；

所述检测酸土环脂芽孢杆菌的方法，使用所述酸土环脂芽孢杆菌检测试剂盒，所述方法包括以下步骤：

1）细菌DNA的提取：

2）环介导等温扩增；

3）显色检测。

本发明的主要原理是利用4条特殊设计的引物及具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA，在1h内能达到10⁹靶序列拷贝，可通过荧光染料来观察扩增效果。

本发明的优点如下：

本发明采用环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术建立了酸土环脂芽孢杆菌的环介导等温扩增检测试剂盒和检测方法，此技术特异性强，与PCR方法有相同的灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪或荧光定量PCR仪，只需普通的水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来检验，加入荧光染料目测观察即可，不用凝胶成像系统，简单快速，特别适合于基层食品检测机构和食品加工企业自检。

采用环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）方法检测酸土环脂芽孢杆菌，为食品安全监控提供新的科学依据。

具体实施方式

下列实施例是进一步对本发明的说明，不应当作对本发明的限制。

实施例1、制备酸土环脂芽孢杆菌检测试剂盒：

（1）环介导等温扩增反应液：