[发明专利]人胱抑素C纳米抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及人胱抑素C纳米抗体及其高灵敏定量检测试剂盒。

背景技术

自比利时布鲁塞尔自由大学的免疫学家Hamers Casterman从骆驼血液中分离出的天然缺失轻链，仅含两条重链，相比传统抗体在结构上简单许多的天然抗体后，基于一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)，因其晶体结构直径为2.5nm、长4nm,纳米抗体概念得以提出。纳米抗体一经发现，它所具有的一些独特特征便引起研究者们的注意。作为一种小分子抗体，纳米抗体有很多的优点。包括：1、分子小，结构稳定，耐热性好。研究证实，将纳米抗体在37℃放置一周或在高温条件(90℃)下保存，都能保持比较好的生物活性。另外，纳米抗体在强变性剂的条件下表现出不易变性或者变性后易复性的特点，研究表明纳米抗体比常规抗体更容易储藏和运输，作为诊断试剂更具有优势。2、亲和力较高。虽然纳米抗体缺少VL，但是VHH自身的一些性质使得纳米抗体仍然保持了较高的亲和力。研究发现从免疫的单域VHH抗体库中分离出来的VHH单体具有nmol/L级的亲和力，并且特异性好；3、对人体的免疫原性弱。目前已有的抗体大都是鼠源的，作用于人体会产生人抗鼠抗体的免疫反应。Revets等将其制备的纳米抗体反复注射小鼠后未见有针对这种单域VHH抗体的抗体产生。所以纳米抗体的免疫原性较弱，与人的生物相容性较好，可能是由于骆驼VHH基因与人VH3家族序列高度同源的原因；4、易表达、易纯化。由于纳米抗体单独能够形成完整的独立结合抗原的结构域，很容易实现可溶性表达，从而使得纳米抗体的生产比一般抗体的生产更加容易，作为诊断试剂的制备也更快、更便宜。

另一方面，血清胱抑素C是首次在鸡蛋清中被发现的，然后分离纯化得到高纯度的半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cysteine Protease Inhibitor，CPI)，后被命名为Cys C，属于CPI超家族，是一种非糖基化的碱性低分子蛋白，相对分子质量为13.6KDa，由120个氨基酸组成，带正电荷，等电点为9.3，编码基因位于20号染色体短臂，长约615kb。胱抑素C是一种分泌性蛋白，广泛存在于各种体液中，如脑脊液、唾液、尿液、精液等，其中脑脊液中的浓度最高，为5.8±2.2mg/L，唾液中胱抑素C含量为1.8±0.88mg/L，血清中的胱抑素C的含量在0.7±0.23mg/L，而尿液中胱抑素C的含量最低，约为0.095±0.057mg/L。胞外胱抑素C含量高可能是由于局部的高分泌速率，或是低的组织液更新速率的结果。

胱抑素C由看家基因控制，在所有有核细胞内表达，并且以恒定的速度产生。在人体多数组织中持续恒定表达，由于胱抑素C相对分子质量低、等电点高，使胱抑素C能被肾小球自由滤过，然后在近曲小管上皮细胞内分解代谢，不被肾小管重吸收和分泌，其排泄仅受肾小球滤过率(GRF)的影响，而不受其它因素如性别、年龄、饮食、炎症和血脂水平等的影响，且与性别、年龄、肌肉量无关。

利用胱抑素C对一些疾病的显著指示作用为人们对某些疾病的早期诊断和及时救治提供了可能性，胱抑素C已在临床评价心脑血管疾病，肾脏移植，血液疾病，甲亢，肿瘤，化疗，儿童、老年人疾病等多个领域得以应用，并显示了良好的应用前景。

然而，现有技术中的检测胱抑素C的检测试剂，如用于配对的单克隆的制备存在困难，专利“一种制备胱抑素C配对单克隆抗体的方法(201110254775.8)”为解决这一困难提供了一种途径。然而，即便如此，此种方法仍然操作繁杂，且所研制出来的单克隆抗体仍然存在部分缺陷，例如敏感性低、再现性差、抗体不易获得等问题。因此，本领域迫切需要开发改进的检测胱抑素C的检测试剂，以满足市场所需。

发明内容

本发明的目的在于提供人胱抑素C纳米抗体及其高灵敏定量检测试剂盒。

在本发明的第一方面，提供一种来源于驼羊或骆驼的纳米抗体（单域重链抗体，VHH），能高亲和力特异性与人胱抑素C结合；且骨架区含有如SEQ IDNO:11所示的共同特征氨基酸序列。

在一个优选例中，所述的纳米抗体中，在抗体超变区含有共同特征氨基酸序列：IT＊＊GNT，其中“＊”代表一个随机氨基酸。

在另一优选例中，所述的纳米抗体具有SEQ ID NO:1-10任一所示的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，其编码前面任一所述的纳米抗体。

在本发明的另一方面，提供一种表达载体，该表达载体中含有所述的多核苷酸。