[发明专利]一种丙型肝炎治疗用药指导的多重基因检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测方法，尤其是一种高通量、准确定量、灵活性强、成本低的一种丙型肝炎治疗用药指导的多重基因检测方法。

背景技术

丙型肝炎病毒(HCV)感染者中有超过70％发展成慢性丙型肝炎，在10～20中有20％～50％进展成肝硬化，1％～2％发展成肝细胞肝癌，危害严重。丙型肝炎的抗病毒治疗是缓解和抑制肝硬化和肝癌的重要途径。但抗HCV药物昂贵，且对不同病情有不同用药标准，因此需要检测多种信息以辅助用药治疗。指导丙型肝炎的用药治疗的信息主要有血清丙型肝炎病毒RNA水平，丙型肝炎病毒的基因型和人类相关单核苷酸多态性(SNP)。只有联系病毒亚型类别、病毒在体内的复制水平和患者的个体信息综合分析，才能做到真正的对症下药。目前，主流的检测方法缺点是：技术成本昂贵、复杂：每个样品需要一个芯片，成本大于￥1000/样品，不利于大规模推广；探针的合成与固定比较复杂，特别是制作高密度的探针阵列，是主要的限速步骤。不能精确定量，重复性差。灵敏度较低：芯片法需核酸量较大，一般须先做多重PCR扩增，由于引物较多，容易自身产生二聚体，发夹结构，或由于Tm值不同，而导致扩增目的片段效率不同，进而影响检测的灵敏度。对于不同亚型的混合感染较难分辨。由于芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准。

发明内容

本发明的目的是提供一种高通量、准确定量、灵活性强、成本低的一种丙型肝炎治疗用药指导的多重基因检测方法。

本发明采用如下技术方案：

一种基于毛细电泳的丙型肝炎治疗用药指导的多重基因检测方法，包括如下步骤：

(1)生产“丙型肝炎治疗用药指导多重基因检测试剂盒”；(2)采集患者血液样品，并提取核酸；(3)以样品核酸为模板进行反转录；(4)以反转录产物为模板进行PCR反应；(5)以毛细电泳的方法分离样品。

优选地，所述步骤(3)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后在一定温度下孵育的子步骤。

优选地，所述步骤(3)中的孵育温度分别为48℃、42℃、95℃、4℃。

优选地，所述步骤(4)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后按一定温度进行热循环反应的子步骤。

优选地，所述步骤(4)的子步骤中的热循环温度分别为94℃、60℃、70℃、4℃。

优选地，所述步骤(5)包括制备GeXP遗传分析仪样品、准备分离液、毛细电泳分离样品、结果分析的步骤。

本发明的有益效果为：

1.采用激光诱导荧光-PMT，具有超高灵敏度，重复性好。

2.GeXP采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可将精确分离一个碱基数量差异的片段，能有效分辨出特异性产物，避免假阳性。

3.高通量检测：可以在一个反应当中同时检测丙型肝炎病毒的RNA水平和人类的SNP位点并检测，即一个反应获得三种用药治疗指导信息。

4.精确定量：对病原体基因拷贝数的定量检测有着与荧光定量PCR同样的高精确性。

5.灵活性强：可随时根据需求增加或修改所需研究的SNP位点。

6.成本低：每个样品的检测成本少于￥50，包括了丙型肝炎病毒RNA定量检测、人类SNP位点的检测和感染病毒亚型多种信息，利于大规模推广。

具体实施方式

下面根据实施例对本发明作进一步详细说明。

本发明创立了一种同步检测丙型肝炎病毒RNA水平、人类相关SNP位点和感染丙型肝炎病毒亚型的多重基因检测方案。检测步骤(详见第四节：具体实施方式)：采集患者样品(血样)，提取核酸，以之为模板进行反转录和PCR反应，最终用毛细电泳方法分离PCR产物。

1.检测目标主要

1.)定量检测样品丙型肝炎病毒RNA水平。参见【表1】

2.)检测与丙型肝炎治疗用药相关的SNP位点：rs12979860和rs8099917。

3.)检测丙型肝炎病毒亚型：1a、1b、2、2a、3a、3b、6共七种亚型。

2.建立了可靠地样品质量及反应过程的对照。参见【表1】

1)人DNA和人RNA完整性的对照内参：确保在检验过程中对样品质量的判断，避免假阴性。

 2)正常反应对照内参：监控PCR反应效率，避免假阴性。

3.多重基因检测的引物设计。参见【表2】

表1多重检测目标

表2多重检测引物序列