[发明专利]一种利用重组大肠杆菌发酵生产L-4-羟脯氨酸的方法

说明书

技术领域

一种利用重组大肠杆菌发酵生产L-4-羟脯氨酸的方法，属于微生物基因工程领域。

背景技术

羟脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)为亚氨基酸，是脯氨酸羟基化后的产物，根据其羟基化位置的不同，可分为3-羟基脯氨酸(3-Hyp)或4-羟基脯氨酸(4-Hyp)。自然界中反式-4-羟基脯氨酸较为常见，反式-4-羟脯氨酸是动物组织蛋白如胶原等的重要组成部分。4-羟脯氨酸广泛应用于医药、化工、动物饲料、营养和美容业等方面。在医药方面，4-羟脯氨酸作为原料可用于合成消炎药、碳青霉烯类、血管紧张肽转化酶抑制剂。在化工合成方面，4-羟脯氨酸是合成多种聚合物的必不可少的手性原料，且发挥着重要作用。在家禽饲料中添加羟脯氨酸，可防止因甘氨酸合成不足而造成的营养不良。4-羟脯氨酸在食品营养方面也有重要作用，由于婴儿消化系统不完全，需以羟脯氨酸作为营养物质来补充甘氨酸、丙酮酸和葡萄糖。另外，4-羟脯氨酸还具有消除氧化剂和调整细胞的氧化还原状态的潜在效果，因此许多化妆品中都添加有羟脯氨酸，以期保养皮肤和延缓衰老。

目前，合成4-羟脯氨酸的方法有化学合成法、生物提取法以及微生物酶法。生物提取法利用动物蛋白来源如明胶、猪皮为原料经酸、碱或蛋白水解酶水解后提取羟脯氨酸，该法纯化步骤长，提取率低，成本高，浪费大量原料，且废弃物污染严重，很容易被市场淘汰。而化学合成方法合成步骤较多，成本高，也不适合工业生产。随着DNA重组技术的发展以及微生物资源的发现，使得发酵法生产4-羟脯氨酸成为工业上很有前景的生产方法。

目前国内尚未有报道利用重组大肠杆菌发酵法生产4-羟基脯氨酸。

发明内容

针对目前生物提取法获得L-4-羟脯氨酸成本高，污染大，提取率低的缺陷，本发明要解决的问题是提供一种利用重组大肠杆菌发酵生产L-4-羟脯氨酸的方法。

本发明通过将经密码子优化后的脯氨酸-4-羟化酶基因连接在高效启动子上，在大肠杆菌中过量表达该羟化酶，在发酵培养基中以葡萄糖为碳源，并通过添加L-脯氨酸来获得L-4-羟脯氨酸。

本发明所述的一种利用重组大肠杆菌发酵生产L-4-羟脯氨酸的方法，其特征在于，所述的重组大肠杆菌由如下方法构建：将色氨酸串联启动子P2trp和脯氨酸-4-羟化酶结构基因Hyp连接到pAMP质粒上，构建含Hyp基因的表达载体pAMP-P2trp-Hyp，将所构建的重组质粒pAMP-P2trp-Hyp转化至大肠杆菌中，得到过量表达脯氨酸-4-羟化酶基因的重组大肠杆菌。

其中，所述的Hyp结构基因来源于指孢囊菌(Dactylosporangium sp)。

上述的色氨酸串联启动子来源于ptrpL1质粒(购自Stratagene，Germany)。

上述表达Hyp基因的载体为pAMP，该质粒来源于上海旭冠公司。

本发明所述重组大肠杆菌的构建步骤：

1色氨酸串联启动子的优化

色氨酸串联启动子来源于ptrpL1质粒(购自Stratagene，Germany)，该质粒的色氨酸启动子来源于大肠杆菌K12菌株的色氨酸操纵子，是一个适合工业生产应用的强启动子，在SD序列跟起始密码子序列之间有Cla I酶切位点，同时，色氨酸启动子的-35区上游有HindIII酶切位点，这样便于将启动子连接到其他的表达载体上，同时，利用酶切等分子操作还可以优化SD序列与起始密码子之间的距离，使得目的基因得到高效表达。由于两个色氨酸启动子串联起来可提高表达强度，因此，根据ptrpL1质粒的色氨酸启动子，通过全基因合成，合成色氨酸串联启动子。

2脯氨酸-4-羟化酶基因的优化

基本方法是根据指孢囊菌(Dactylosporangium sp)的脯氨酸-4-羟化酶基因，通过优化羟化酶基因的密码子，消除一些低使用率的密码子，同时通过同义转换，优化mRNA的一级结构，使得核糖体能够顺利地沿着起始密码子向后翻译。并利用同义转化方法消除HindIII，BamH I，EcoR I酶切位点。通过个基因合成，合成脯氨酸-4-羟化酶基因。

3脯氨酸-4-羟化酶基因表达载体的构建

基本方法是通过全基因合成的方法合成色氨酸串联启动子基因和优化后的脯氨酸-4-羟化酶基因，然后根据设计的酶切位点，将启动子基因连接在羟化酶基因的5’端，最后，将带有色氨酸串联启动子基因的脯氨酸-4-羟化酶基因片段连接到pAMP质粒上，构建重组质粒pAMP-p2trp-Hyp。

44-羟脯氨酸发酵重组菌株的构建