[发明专利]酶法制备谷胱甘肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及制备谷胱甘肽的方法，尤其涉及一种酶法制备谷胱甘肽的方法。

背景技术

谷胱甘肽广泛存在于动植物和微生物中，是生物体内最重要的非蛋白巯基化合物之一，具有还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG），生物体内大量存在并起主要作用的是GSH，广泛用于治疗肝脏疾病、肿瘤、氧中毒、衰老和内分泌疾病，并作为生物活性添加剂及抗氧化剂用于食品领域。

GSH由谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）和甘氨酸（Gly）通过肽键形成，分子中有一特殊的γ肽键，即由谷氨酸的γ-COOH与半胱氨酸的α-NH2缩合成的肽键，它不同于蛋白质分子中的普通肽键。GSH为白色晶体，易溶于水、低浓度乙醇水溶液、液氨和二甲基甲酰胺。两分子GSH脱氢后以二硫键相连形成氧化型谷胱甘肽（GSSG），又称谷胱甘肽二硫化物，多以水合物形式存在，是溶于水的白色晶体。

目前谷胱甘肽的主要制备方法有：溶剂萃取法、化学合成法、生物发酵法和酶法。从谷物胚芽中提取GSH，由于GSH得率低、成本高、有机溶剂污染严重、纯度不高，而且消耗大量粮食，现已很少使用。化学合成法合成GSH，由于活性产物不易分离，需要化学拆分，产品纯度不高，难以推广。

近年颇受重视的是将编码GSH合成酶系的基因克隆到大肠杆菌或酵母中，使用微生物发酵生产GSH。酵母发酵法，工艺较成熟，但产量有待提高，而且下游工艺处理复杂。与三磷酸腺苷（ATP）再生体系偶联合成GSH，乙酰激酶尽管效率较高，但乙酰磷酸的高价格及稳定性限制了此法的产业化；酵母糖酵解途径成本低廉，虽在胞二磷胆碱和NADP的合成方面获得成功，但合成GSH的效率较低，主要是ATP再生反应效率不高，反应条件与GSH酶系催化合成GSH的条件不协调以及由此造成的成本较高限制了此方法潜力的发挥。

近年来国内外GSH生产基本采用发酵法，酶法生产GSH的技术还未成形。有研究者提出用固定化酶技术生产GSH，通过调节GSH I和GSH II两种酶的比例，将两种酶固定在载体上，通过加入底物和ATP来生产GSH。但是该方法存在以下问题，直接限制了该技术的工业化应用：

1）GSH I和GSH II两种酶固定在一起，无法解决两步反应之间的相互抑制，影响了生产速度；

2）固定化酶技术未解决酶活性的稳定性问题，提高了生产酶的成本；以及

3）酶法合成的最大问题是ATP的来源，由于ATP价格昂贵，使得利用酶法合成GSH的成本比传统发酵法高很多。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种大规模、低成本、工业化生产GSH的方法，解决目前酶法生产GSH存在的问题。

本发明提供了一种酶法制备谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：

（1）在反应罐A中生成γ-谷氨酰半胱氨酸；

（2）在过滤器E1中分离GSH I酶；

（3）在反应罐B中生成谷胱甘肽；

（4）在过滤器E2中分离GSH II酶；以及

（5）分离产物GSH。

本发明方法进一步包括以下步骤：

（6）在再生罐C中利用二磷酸腺苷（ADP）和/或磷酸腺苷（AMP）再生ATP，并分离生成的ATP。

本发明方法还可进一步包括以下步骤：

（7）所述步骤（2）中分离的GSH I酶的循环利用，即将分离的GSH I酶添加至反应罐A中生成γ-谷氨酰半胱氨酸的连续反应；以及

（8）GSH I酶的连续分离，即在过滤器E1中连续分离GSH I酶。

本发明方法还可进一步包括以下步骤：

（9）所述步骤（4）中分离的GSH II酶的循环利用，即将分离的GSH II酶添加至反应罐B中生成谷胱甘肽的连续反应；以及

（10）GSH II酶的连续分离，即在过滤器E2中连续分离GSH II酶。

本发明方法还进一步包括以下步骤：

（11）产物GSH的连续分离。

在本发明方法中，循环利用GSH I酶和GSH II酶、以及再生ATP至少一次，即重复所述步骤（6）至所述步骤（11）至少一次，优选重复多次，例如重复2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50次等。

本发明方法中，在反应罐A中生成γ-谷氨酰半胱氨酸的反应如下：

反应温度为25-60℃，优选30-55℃，更优选35-50℃，最优选37-45℃；

反应PH为5-10，优选6-10，更优选7-9的条件下；