[发明专利]一种生产辅酶Q10工程菌的构建方法、工程菌及其应用

权利要求书

1.一种生产辅酶Q10的工程菌的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

a.从类球红细菌中提取基因组DNA；

b.用聚合酶链式反应扩增出DXS和DDS的同源基因；

c.用扩增出的同源基因与广宿主质粒连接，构建重组载体；

d.重组载体转化至大肠杆菌S17-1中；

e.将大肠杆菌S17-1与类球红细菌接合转移，即得工程菌。

2.根据权利要求1所述的生产辅酶Q10的工程菌的构建方法，其特征在于：所述的DXS基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；所述的DDS基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的生产辅酶Q10的工程菌的构建方法，其特征在于：所述的广宿主质粒为克隆载体pBBR1MCS-2；所述质粒的启动子为tac启动子。

4.一株利用如权利要求1-3任一所述的构建方法得到的工程菌，其特征在于：该菌为类球红细菌，拉丁文学名为Rhodobacter sphaeroides；命名为NHU-ZDD菌株；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间：2012年4月13日；保藏编号：CGMCC No.5998。

5.利用如权利要求4所述的工程菌生产辅酶Q10的方法，其特征在于，具体步骤如下：

f. 挑取NHU-ZDD菌株单克隆接种于含10mL种子培养基的50mL摇瓶中，转速为200rpm，在26-34℃培养23h，获得一级种子；

g. 将一级种子按1%的比例转接至含20mL种子培养基的50mL摇瓶中，在26-34℃，200rpm的条件下培养23h，获得二级种子；

h. 将二级种子以1%的比例接种至含100mL发酵培养基的500mL中，在26-34℃，200rpm的条件下培养72h后，添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，诱导表达48h，收集菌液；并提取辅酶Q10。

6.利用如权利要求5所述的生产辅酶Q10的方法，其特征在于：所述的种子培养基每100mL中含有：(NH₄)₂SO₄ 0.25g，玉米浆 0.05g，酵母提取物 0.14g，NaCl 0.2g，葡萄糖 0.3g，K₂HPO₄ 0.05g，KH₂PO₄ 0.05g，MgSO₄ 0.1g，FeSO₄ 0.01g，CoCl₂ 0.003g，MnSO₄ 0.0001g，CaCO₃ 0.8g，维生素B1 0.1μg，维生素K 0.1μg，维生素A 0.15μg；pH调节为7.2。

7.利用如权利要求5所述的生产辅酶Q10的方法，其特征在于：所述的发酵培养基每100mL中含有：(NH₄)₂SO₄ 0.3g，NaCl 0.28g，葡萄糖 4g，KH₂PO₄ 0.15g，味精 0.3g，MgSO₄ 0.63g，玉米浆 0.4g，FeSO₄ 0.12g，CoCl₂ 0.005g，CaCO₃ 0.6g，维生素B1 0.1μg，维生素K 0.1μg，维生素A 0.15μg；pH调节为7.2。

8.利用如权利要求5所述的生产辅酶Q10的方法，其特征在于：所述异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的浓度为0.001-10mM。