[发明专利]竞争法胶乳颗粒增强免疫比浊C肽检测试剂盒及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是生物技术领域，具体涉及的是竞争法胶乳颗粒增强免疫比浊C肽检测试剂盒，本发明还涉及该试剂盒的制备方法。

背景技术

测定C肽能得知胰岛细胞的功能，对糖尿病的诊断和治疗具有很大的意义，C肽没有胰岛素的功能，而胰岛B细胞分泌的胰岛素和C肽呈等分子关系，这也就是说，分泌几个胰岛素分子，同时必然分泌几个C肽分子。血清C肽浓度可间接反应胰岛素浓度。C肽不受肝脏酶灭活，半衰期比胰岛素长，经肾脏直接在尿中排泄，故血中C肽的浓度可更好地反映胰岛素的功能。

正常基础状态下C肽水平为0.4±0.2纳摩/升。在口服葡萄糖耐量试验（标准馒头餐试验）的同时可抽血测定空腹血糖负荷后1小时、2小时、3小时的血清C肽水平，正常人在服糖60分钟后C肽水平升高至基础水平的3倍以上。1型糖尿病C水平极低（＜0.2纳摩/升），胰岛功能减退者餐后C肽升主的幅度常低于3倍。对于接受胰岛素治疗的患者，用测定血中胰岛素水平不能评价自身胰岛功能时，可以测定C肽水平来评价自身胰岛B细胞功能。

目前已有的C肽测定方法有化学/电化学发光免疫检测、放射免疫检测、酶联免疫检测，其缺点是检测时间普遍较长（约30min），且检测费用昂贵。

传统的胶乳颗粒增强免疫比浊法检测抗原物质时采用的是夹心法检测原理，即被检测物抗原与样本稀释液（试剂1）混合后孵育一定时间，再与包被有对应抗体的纳米颗粒（试剂2）发生抗原抗体反应，形成不容性的免疫复合物，在全自动生化仪上表现为吸光度上升（形成一定的吸光度变化值），这种吸光度的变化值与被测物质抗原含量正相关，使用已知浓度的标准品绘制标准曲线，则可根据被测标本的反应吸光度变化计算出其含量。其要求是抗原物质要有两个以上的无空间位阻的抗原表位。但是，C肽由于只有31个氨基酸，无空间位阻的抗原表位较少，采用夹心法检测难度较高。

发明内容

本发明的目的在于解决目前夹心法检测C肽难度较高，检测时间长的问题，提供一种速度快、检测简便的竞争法胶乳颗粒增强免疫比浊C肽检测试剂盒及制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

竞争法胶乳颗粒增强免疫比浊C肽检测试剂盒，由胶乳颗粒以及反应缓冲液组成，所述胶乳颗粒包被有以下人工合成的氨基酸序列：

EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ-X；X由2～4个K组成。

进一步，所述反应缓冲液中含有抗EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ抗原表位的单克隆抗体。

更进一步地，所述竞争法胶乳颗粒增强免疫比浊C肽检测试剂盒是基于免疫竞争法对检测样本中的C肽进行定量测定。

竞争法胶乳颗粒增强免疫比浊C肽检测试剂盒的制备方法，包括胶乳颗粒的制备和反应缓冲液的制备，所述胶乳颗粒的制备方法由以下步骤组成：

（a1）活化胶乳颗粒，离心，去上清，使用HEPES缓冲液复溶；

（a2）加入人工合成的氨基酸序列EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ-X，室温下反应2小时；

（a3）加入上述反应体积1/100的1M甘氨酸，以及10%BSA溶液，反应30min；

（a4）离心，去上清，使用HEPES缓冲液复溶即制成成品。

为了更有效的得到所需胶乳颗粒；所述离心的条件为22000rpm，离心的时间为10min。

作为一种优选，所述（a1）中活化胶乳颗粒所采用的试剂为EDC和S-NHS。

进一步，所述反应缓冲液制备过程如下：

在100mM的MES缓冲液中加入终浓度为0.001～0.1mg/ml的抗EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ抗原表位的单克隆抗体。

本发明原理是：纳米颗粒包被的是和被测抗原物质相同或相似的抗原，与一定量的对应的抗体发生抗原抗体反应，形成不容性的免疫复合物，在全自动生化仪上表现为形成一定的吸光度变化值。当被测物中含有此种抗原时，由于竞争原理，所形成的吸光度变化值与无被测物质时相比下降，在竞争法中吸光度的变化值与被测物质抗原含量负相关，使用已知浓度的标准品绘制标准曲线，则可根据被测标本的反应吸光度变化计算出其含量。

本发明具有以下优点及有益效果：

1、在C肽的抗原测定中，由于其抗原太小，较难提供形成夹心免疫复合物的多个抗原表位；使用本发明无需形成多个抗原表位，即可有效的对C肽进行检测，使检测方法更简便，检测结果更准确。