[发明专利]一种利用细胞脱壁试剂评测细胞贴壁强度的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种测量方法，具体地说是一种利用细胞脱壁试剂评测细胞贴壁强度的方法。

背景技术

细胞贴壁强度的检测是在生命科学研究及基础医学研究中经常遇到的问题。现有的细胞贴壁强度检测方法各有局限：利用飞秒激光发射装置和原子力显微镜进行检测的方法（如《Noncontact estimation of intercellular breaking force using a femtosecond laser impulse quantified by atomic force microscopy》所述的方法）虽然测量准确，对细胞无接触式伤害，但由于其所需设备及技术门槛过高，且检测耗时较长，操作繁琐，不利于该技术的普及和大范围应用；转碟法（如《A novel mode of cell detachment from fibrillar fibronectin matrix under shear》所述的方法）虽然所需器材和技术门槛较低，但是需要对不同半径处的贴壁细胞进行计数，使得检测耗时较长，操作繁琐，而且其使用离心力这一非生物因素作为评价标准，影响了结果的准确性和生物学意义。

发明内容

要解决的技术问题

为了避免现有技术的不足之处，本发明提出一种利用细胞脱壁试剂评测细胞贴壁强度的方法，克服现有技术操作繁琐、不易于实现自动化、仪器及技术门槛过高的缺点。

技术方案

一种利用细胞脱壁试剂评测细胞贴壁强度的方法，其特征在于步骤如下：

步骤1：以3～5×10⁴个/cm²的密度在细胞培养板中的多个孔中接种细胞，，置于37℃细胞培养箱中培养24h，使其充分贴壁；

步骤2：将细胞脱壁试剂进行倍半稀释，得到一组脱壁试剂溶液浓度，各脱壁试剂溶液的浓度梯度的稀释倍数分别为2⁰、2¹、2²、2³、2⁴、2⁵、2⁶；

步骤3：吸干细胞培养板中的培养基，分别将一组脱壁试剂溶液中的每个脱壁试剂溶液浓度和磷酸盐缓冲液PBS加入细胞培养板中不同的孔内，温育5～20min，进行充分反应；温育5～20min，进行充分反应；

步骤4：将细胞固定液加入细胞培养板中，然后将细胞培养板置于振荡器或摇床上，震荡5～50min，以使细胞充分固定；

步骤5：检测每个孔内中仍贴壁的细胞的数量，并以PBS处理组的检测值为标准值，做归一化分析，得出一组脱壁试剂溶液浓度梯度的贴壁细胞比例N_A；

重复步骤3～步骤5：每个浓度梯度处理组做3个以上的重复；再做一组不吸干培养基的阴性对照，作为细胞接种数误差的对照；所述磷酸盐缓冲液PBS和脱壁试剂浓度溶液的体积一样；

步骤6：对细胞贴壁强度评测

1．以各浓度梯度处理组的N_A值为横坐标，以各N_A值对应的脱壁试剂稀释倍数D为纵坐标得到曲线图，以最小二乘法拟合曲线公式，得到N_A=F(D)；

2．选取¹/₂N_A（PBS）为标准，代入上述曲线公式N_A=F(D)，计算出此时对应的脱壁试剂稀释倍数，D_50％，并以D_50％表征此种细胞的贴壁强度。

所述的细胞固定液和脱壁试剂均采用PBS作为溶剂配制。

所述细胞脱壁试剂为0.025％～0.5％的胰酶溶液或0.01％～0.2％的EDTA溶液。

有益效果

本发明提出的一种利用细胞脱壁试剂评测细胞贴壁强度的方法，有益效果是：由于采用细胞脱壁试剂这类细胞生物学中常用的实验试剂减弱细胞与基底间的粘附作用，之后固定细胞，检测处理后各浓度梯度处理组的贴壁细胞数，并以PBS处理组的检测值为标准值，做归一化分析，制作以N_A为横坐标，以D为纵坐标的曲线图，以¹/₂N_A（PBS）对应的稀释倍数D_50％来表征该种细胞的粘附强度。与现有技术相比，本发明体现了减少实验耗时，简化实验步骤，易于实现自动化批处理，提高测定精度及结果平行性的有益效果。

具体实施方式