[发明专利]促红细胞生成素模拟肽融合蛋白及突变体

说明书

技术领域

本发明涉及人红细胞缺乏症如贫血等疾病的治疗药物。具体的，本发明提供一种用于治疗人各种类型贫血的融合蛋白及其制备方法和应用。所述融合蛋白含有促红细胞生成素模拟肽(EMP-1)和人IgG2-Fc(铰链区-CH2-CH3)或IgG2-Fc突变体(T250Q/M428L；T307Q/N434A；N434S)，能有效改善贫血患者的生存状况，同时增加EMP-1体内的半衰期，尤其是EMP-1与IgG-Fc(T250Q/M428L；T307Q/N434A；N434S)突变体融合蛋白，增强与FcRn亲和力，进一步增加EMP-1的体内半衰期。

背景技术

促红细胞生成素(EPO)是由165个氨基酸和4个糖链组成的糖蛋白激素，通过特异结合红血球前体细胞表面上的特异性的受体，发挥红细胞生成的主要调节剂作用。此过程能够发出它们增殖和向成熟的红细胞分化的信号。促红细胞生成素受体是对促红细胞生成素具有高亲和力的484-氨基酸糖蛋白(Anna-Leena Sirén等，Acta Neuropathologica，1996(101)，271-276)。对于促红细胞生成素受体来说，配体诱发的同二聚体化作用是控制活化的关键因素。

健康的哺乳动物体内血浆中EPO的浓度非常低，正常情况下现有循环数目的红细胞足以满足组织对养料的需求。EPO的存在会刺激新的红细胞的生成，以替代在老化过程中损失的那些红细胞(Iain C Macdouga1l等人，Kidney Internationa1，1996(50)，1694-1699)。但是，某些疾病状态经常出现异常的红细胞生成。在许多国家，使用重组人EPO(rHuEPO)治疗红细胞减少的各类贫血性疾病。美国食品和药品管理局(U.S.Food and Drug Administration；FDA)已经批准了重组人EPO在治疗末期肾病有关的贫血中的用途。接受血液透析来治疗肾病相关贫血患者一般患有严重的贫血，后者作为透析治疗的结果，由红细胞的破裂和过早死亡造成。EPO也用于治疗其它类型的贫血。例如，可以用EPO治疗化疗诱发的贫血、与脊髓发育不良有关的贫血、与各种先天性障碍有关的贫血、AIDS-有关的贫血和早熟-有关的贫血。另外，EPO可以在其它的领域起作用，例如在骨髓移植患者、准备自体输血的患者和患有铁过载障碍的患者中帮助更迅速地恢复正常的血细胞比容。

促红细胞生成素具有相对较短的半衰期。在患有慢性肾功能衰竭(CRF)的患者中，体内半衰期大约为3～4小时。在治疗剂量范围内，可检测水平的血浆促红细胞生成素能维持至少24小时。皮下施用促红细胞生成素后，在5～24小时内达到峰值血清水平，此后缓慢下降。因此，需要提供改善的和/或修饰形式的EPO治疗蛋白，其能克服这些问题和本领域已知的其它问题。

促红细胞生成素(EPO)是调控红细胞生长的红细胞特异生长因子，EPO受体(EPOR)属于造血生长因子受体超家族成员，这一家族缺乏胞内激酶活性。寻找EPO受体肽配体的研究最初与IL-1R相同，将可溶性受体蛋白固定于抗体基质上，通过筛选随机的噬菌体展示肽文库对促红细胞生成素受体的亲和力，几个研究组鉴别出了促红细胞生成素的小肽模仿物(Peptidomimetics)。得到单一的环八肽序列RIGPITWC，可竞争EPO与EPO受体的结合，IC50为10μmol/L。以此作为前导肽构建限制性文库，筛选得到与ERO受体特异结合的肽配体，这些肽含有高度保守的核心序列GPLTW和成对的半胱氨酸；另外，在二硫桥外还发现有一高度保守的Y残基，此Y残基在短肽活化受体时有很重要的作用。化学合成一组与核心序列最为匹配的肽，它们能够与EPO竞争结合EPO受体，其IC50为0.2～1μmol/L，活性提高了10～50倍。这些序列与促红细胞生成素没有同源性。在功能测定中，这些肽中的几种表现出了活性，但仅是重组促红细胞生成素的活性的1/100,000。尽管已经通过制备肽模仿物的共价二聚体或多聚体，进行了提高这些肽的效力的几种尝试，但在摩尔基础上，这些化合物仍然是促红细胞生成素的活性的1/10,000～1/1,000，且具有非常短的半衰期，这使得它们不适用作治疗剂(US patent7393662完全引述作为参考)。