[发明专利]一种白细胞介素‑1受体拮抗剂突变体

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明公开了一种生物受体拮抗剂突变体。

背景技术

白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)是一种存在于人体的蛋白质类细胞因子受体拮抗剂，通过结合白细胞介素-1(IL-1)受体，特异性地封闭IL-1的活性。美国食品和药物管理局(FDA)在2001年11月批准Amgen公司的IL-1Ra(商品名Kineret)上市，治疗常规药物无效的顽固性类风湿关节炎。这是继美国Immunex公司的重组肿瘤坏死因子受体(商品名Enbrel)上市后，第二个上市的治疗类风湿关节炎的基因工程药物。

1990年，美国Synergen公司的Eisenberg等人在英国Nature杂志首次报道了克隆IL-1Ra的全长cDNA的结果，发现IL-1Ra与IL-1在结构上有同源性，在基因定位上与IL-1的2个亚型基因连锁，并且重组IL-1Ra能够特异性抑制IL-1的活性，这是第一个被发现的内源性细胞因子受体拮抗剂，为治疗炎症性疾病提供了新的途径。由于IL-1Ra的广谱抗炎作用，它还有可能在多种炎症性疾病的治疗中发挥疗效。例如，动物实验证明，IL-1Ra能有效治疗狗的骨关节炎、大鼠脑缺血再灌损伤、大鼠肠炎模型、豚鼠哮喘模型、小鼠肺纤维化、大鼠肾小球肾炎、小鼠移植物抗宿主反应等。我国学者发表的论文也证实IL-1Ra能有效治疗小鼠急性肺损伤、兔的严重角膜烧伤、大鼠角膜移植免疫排斥反应、大鼠实验性肝纤维化等。因而，IL-1Ra具有广阔的临床应用前景。目前，IL-1Ra开发的一个主要障碍是它的临床应用剂量很大，治疗类风湿关节炎需要每针75-150毫克的剂量，因此目前仍需要活性更高的白细胞介素-1受体拮抗剂。

发明内容

本发明的申请人在已有的白细胞介素-1受体拮抗剂：IL-1Ra野生型(其氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ.I.D.NO1、SEQ.I.D.NO2所示)X线衍射晶体结构的基础上，对其活性中心附近的氨基酸进行了随机突变，获得了与白介素-1受体亲和力更高、生物活性更佳的突变体。

本发明公开了五种白细胞介素-1受体拮抗剂突变体，分别为SEQ.I.D.NO.1氨基酸的第9位、第26位、第40位氨基酸单点突变，其中第9位赖氨酸突变为亮氨酸或异亮氨酸、第26位精氨酸突变为赖氨酸、第40位缬氨酸突变为亮氨酸和SEQ.I.D.NO.1氨基酸的第9位、第26位、第40位氨基酸三点突变，其中第9位赖氨酸突变为异亮氨酸、第26位精氨酸突变为赖氨酸、第40位缬氨酸突变为亮氨酸。

本发明还公开了上述白细胞介素-1受体拮抗剂突变体的制备方法，包括首先IL-1Ra野生型基因的获得然后获得各种突变体基因、IL-1Ra(突变体)表达载体构建、目的基因的表达和目的蛋白的纯化四个步骤，其中表达质粒为pET-22b(+)质粒，转化宿主菌为BL21(DE3)。

得到的目的蛋白通过活性实验检测，结果表明野生型白细胞介素-1受体拮抗剂：IL-1Ra野生型中和拮抗IL-1的生物活性为国外已上市的Kineret(N端甲硫氨酸形式的白细胞介素-1受体拮抗剂)的2倍，各突变体的生物活性均优于野生型，其中三点突变的生物活性最好，为野生型的5倍。

本发明公开的上述白细胞介素-1受体拮抗剂突变体可以用来制备治疗炎症性疾病药物中的用途，其中炎症性疾病包括关节炎、肠炎、哮喘、肺纤维化、肾小球肾炎、移植物抗宿主反应、急性肺损伤、严重角膜烧伤、类风湿性关节炎。本发明公开的上述白细胞介素-1受体拮抗剂突变体优选用于类风湿关节炎的治疗。

附图说明

图1：人IL-1Ra基因RT-PCR扩增结果1.RT-PCR扩增产物；2.DNA Marker，自上而下为2、1、0.75、0.5、0.25、0.1kb；

图2：pET-22b(+)物理结构图：其中T7为T7启动子，lacI为lacI编码区，ori为复制起始位点，Ap为氨苄青霉素抗性基因，fl origin为fl复制起始位点；

图3：pET-22b(+)/IL-1ra物理结构图，相应部位同图2；

图4：含有人IL-1Ra cDNA的T载体双酶切图谱，其中1、2、3为质粒双酶切产物，4为DNA Marker，自上而下为21、5.1、4.9、1.9、1.38、1.37、0.95、0.56kb；