[发明专利]人脂肪干细胞增殖促进剂及其应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术及细胞工程领域，特别涉及一种人脂肪干细胞增殖促进剂。

背景技术

人脂肪干细胞即人体脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）是目前广泛应用于组织工程及再生医学领域的一种成体干细胞，与骨髓间充质干细胞一样具有多向分化潜能。ADSCs呈成纤维细胞样生长，胞浆和核仁丰富，呈平行或漩涡样排列。细胞周期分析显示G0/G1期的细胞占69%，S期占24%，G2/M期占8%。在胎牛血清的存在条件下传代培养2-3天细胞增殖1倍。多次传代(10-20代)后,细胞增殖速度无明显减慢，在传代6次后细胞群体中出现衰老细胞，第15代细胞群体中衰老细胞约占15%[3]。ADSCs具有与骨髓间充质干细胞基本相同的细胞免疫表型，经流式细胞仪分析CD9,CD10,CD13,CD29,CD44,CD49d,CD49e,CD54,CD55,CD59,CD90,CD105,CD117,CD146,CD166,STRO-1均为阳性,而CD31,CD34,CD45均为阴性。最大的区别是ADSCs表达CD49d,不表达CD106;而正好相反,BMSCs表达CD106,不表达CD49d。

目前常用的ADSCs分离培养方法是从脂肪组织分离获取细胞，经机械和酶处理方法除去红细胞等成熟细胞后，利用饲养层细胞与采用含10%胎牛血清的培养基进行培养。这种培养干细胞方法的缺点是方法复杂，提取的干细胞数量少，纯度不高，继代增殖缓慢。

发明内容

本发明的目的是提供一种人脂肪干细胞增殖促进剂，用于提高继代增殖效率。

常用的培养干细胞方法的缺点是方法复杂，提取的干细胞数量少，纯度不高，继代增殖缓慢。

根据本发明的一个方面，提供一种人脂肪干细胞增殖促进剂，其特征在于:由胰岛素、氢化可的松、甲状旁腺激素、雌二醇、睾酮、血小板衍生生长因子-AB、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、白血病抑制因子、L-抗坏血酸、生物素、地塞米松、胰岛素样生长因子IGF-I和人干细胞因子SCF组成。在加入人脂肪干细胞培养基后人脂肪干细胞增殖促进剂中各成分作用浓度依次为胰岛素浓度为0.1~10μg/mL、氢化可的松浓度为10^-10~5×10^-9mol/L、甲状旁腺激素浓度为2×10^-10~7×10^-10mol/L、雌二醇浓度0.2~3.5ng/mL、睾酮浓度为0.8~15ng/mL、血小板衍生生长因子-AB浓度为1~8ng/mL、表皮生长因子浓度为2~16ng/mL、碱性成纤维细胞生长因子浓度为2~20ng/mL、L-谷氨酰胺优选浓度为0.4~4mmol/L、2-巯基乙醇浓度为0.07~0.15mmol/L、白血病抑制因子浓度为1~7ng/mL、L-抗坏血酸浓度为10~80μg/mL、生物素浓度为10~45μg/mL、地塞米松浓度为10^-8~5×10^-8mol/L、IGF-I浓度为1~10ng/mL和SCF浓度为0.8~15ng/mL。其中胰岛素最优选浓度为6.25μg/mL，氢化可的松最优选浓度为1×10^-9mol/L，甲状旁腺激素最优选浓度为5×10^-10mol/L，雌二醇最优选浓度为1ng/mL，睾酮最优选浓度为4ng/mL，血小板衍生生长因子-AB最优选浓度为4ng/mL，表皮生长因子最优选浓度为10ng/mL，碱性成纤维细胞生长因子最优选浓度为10ng/mL，L-谷氨酰胺最优选浓度为2mmol/L，2-巯基乙醇最优选浓度为0.1mmol/L，白血病抑制因子最优选浓度为5ng/mL，L-抗坏血酸最优选浓度为50μg/mL，生物素最优选浓度为33μg/mL，地塞米松最优选浓度为10^-8mol/L，IGF-I最优选浓度为5ng/mL，SCF组成最优选浓度为5ng/mL。

本发明提供对维持细胞指数生长的激素和各种生长因子作用如下：

insulin胰岛素：能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸

hydrocortisone氢化可的松：刺激干细胞的生长，保证细胞功能

parathyroid hormone甲状旁腺激素：刺激干细胞的生长

estradiol雌二醇：刺激干细胞的生长，保证细胞功能

testosterone睾酮：刺激干细胞的生长，保证细胞功能