[发明专利]一株特基拉芽孢杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一株特基拉芽孢杆菌及其应用。

技术背景

芽孢杆菌种类繁多，分布广泛，主要存在于土壤、水、空气以及动物的肠道等处。且胞外酶种类丰富，具有很好的研究前景。由于生长环境的复杂性，芽孢杆菌也会分泌产生纤维素酶，如β-葡聚糖酶。β-葡聚糖酶在啤酒酿造中有着广泛的应用：在糖化过程中使用β-葡聚糖酶，可以降低麦汁的粘度，使过滤速度加快，从而降低能耗；另外，在麦汁中加入β-葡聚糖酶还能减少葡聚糖含量，防止啤酒浑浊，从而提高啤酒的非生物稳定性。麦类饲料中由于含有较高的β-葡聚糖，阻碍了饲料中有效成分在动物肠道中的消化吸收，成为一种抗营养因子，并且为致病菌的寄居繁殖提供丰富的营养，会引起畜禽腹泻等问题，在饲料中添加适量的β-葡聚糖酶将有效解决上述问题，从而提高饲料的利用率。

我国为啤酒生产大国，2011年啤酒产量达4610万千升，啤酒产量的不断攀升意味着β-葡聚糖酶需求量也逐日增加。目前国内使用的酶制剂除少量饲料用酶制剂为国内生产，大部分酶制剂都依赖于进口产品，由于生产技术属于商业机密，这在极大程度上限制了啤酒及饲料工业的发展，发展具有独立知识产权的工业酶制剂技术具有重大意义。分离筛选高产β-葡聚糖酶的微生物是酶技术的基础，我国地域辽阔，环境状况复杂，造就了丰富的微生物资源，为分离筛选工作的开展提供了多种可能。以分离的一株产β-葡聚糖酶野生菌为资源，结合育种技术，获得高产β-葡聚糖酶的工业生产菌株，最终为工业酶制剂的生产提供新的思路与资源。

发明内容

本发明提供了一株特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）CGX5-1。

本发明所提供的特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）CGX5-1，已于2012年3月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CGMCCNo.5935。

本发明提供了一种所述特基拉芽孢杆菌的应用，从培养好的特基拉芽孢杆菌中调取β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因、酸性、中性及碱性蛋白酶类基因等进行外源表达，构建工业酶制剂的基因工程菌。

所述特基拉芽孢杆菌为从马蜂巢穴残片中筛选，其保藏条件如下：从生长良好的平板上取1环芽孢杆菌移入LB培养基中，37℃摇瓶培养15h，取0.75mL移入盛有0.25mL无菌40%甘油的甘油管中，放-70℃冰箱保存。

所述LB培养基为：Tryptone 10g L^-1，Yeast Extract 5g L^-1，Nacl 10g L^-1，pH7.0。

发酵培养基为：玉米粉40g L^-1，豆饼粉61.1g L^-1，大麦粉68.4g L^-1，磷酸氢二钾1g L^-1，氯化钙0.1g L^-1，硫酸镁1g L^-1，高温淀粉酶16μL/L。

所述特基拉芽孢杆菌培养条件为：将甘油管保藏的芽孢杆菌接入LB液体培养基，在37℃200rpm摇瓶培养15h至对数中后期，作为种子液。以2%接种量将种子液转接至发酵培养基中，37℃200rpm培养，分别于12、24、36、48、60h为取样点，测定样品中β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活力。

生物材料保藏

本发明所提供的特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）CGX5-1，已于2012年3月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CGMCCNo.5935。

具体实施方式

实施例1 特基拉芽孢杆菌筛选及酶活测定方法

从马蜂巢穴的残片中取一定样品加入到30mL无菌生理盐水，玻璃珠打散制成悬浊液，80℃处理10min。将悬浊液梯度稀释，涂布于添加2%刚果红的MRS平板，37℃培养箱中培养24h。挑取使刚果红变色圈明显的的单菌落。反复进行平板划线分离，重复三次得到纯化的单菌落，供下一步鉴定用。

鉴定主要通过：1)菌落特征观察：用肉眼直接观察，挑选菌落直径在1-1.5mm之间，圆形，表面光滑稍有褶皱，乳白色等符合芽孢杆菌菌落特征的菌株。2)个体形态观察：用光学显微镜革兰氏染色观察。挑选革兰氏阳性、有芽孢的菌株。将满足鉴定条件的菌株挑出甘油管保藏。