[发明专利]一种β-1,3-1,4-葡聚糖酶及其编码基因

说明书

技术领域

本发明涉及一种β-1,3-1,4-葡聚糖酶及其编码基因，属于酶基因工程和酶工程领域。

技术背景

中国是世界第一大啤酒生产国，2011年啤酒产量达到4900万千升，年需求啤酒大麦350万吨，并以每年10%的速度递增。由于我国啤酒大麦质量不高，每年平均进口啤酒大麦100万吨，约占世界啤酒大麦总贸易量的30%左右，耗外汇3.5亿美元。啤酒大麦绝大部分靠进口的局面，使我国啤酒行业的效益直接受到国际大麦行情的制约，影响到我国啤酒工业的持续发展。因此，啤酒大麦的国产化战略受到高度重视。发展我国啤酒大麦的生产，一方面需要依靠农业科技的进步，走品种改良引进、高产优质栽培之路，另一方面，就是要变革制麦工艺、酿造工艺，实现低等国产大麦的充分利用，调动农民种植积极性。糖化过程中添加能够水解大麦β-葡聚糖的β-1,3-1,4-葡聚糖酶，大大降低了糖化过程中的能耗、提高麦汁得率、改善成品啤酒的品质，使得啤酒厂能够以国产麦芽部分或全部替代进口大麦。我国年产啤酒大麦约为200万吨，目前仅有30％用于酿造工业，如果该三功能酶制剂得到普遍推广，预计可以实现70％的分流，其社会意义十分重大。目前国内也有部分酶制剂公司生产β-1,3-1,4-葡聚糖酶，但其水平远不及国外酶制剂公司，且酶制剂的生产菌种及工艺都是商业机密，国内研发速率缓慢，所以国内市场在很大程度上依然依赖进口。随着中国啤酒工业的大幅度发展，开发活力高、价格低的国产酶制剂十分必要。工业化产品可以填补国产高效廉价β-1,3-1,4-葡聚糖酶的空白，为我国酿造用酶制剂的发展做出了新表率，对于将该酶种大量应用在啤酒酿造工业上有重大的意义。

目前诺维信公司生产的复合酶价格在198-380元/公斤左右，由于价格太高，啤酒厂根本无法采用。如果价格能够下降到啤酒厂能够接受的水平，即100元/公斤左右，则国内啤酒厂可以大幅度推广使用该产品。根据测算，国内啤酒企业的需求量在1500吨左右，随着国产大麦麦芽使用量的进一步增大，该酶用量还会进一步提高，市场潜力在1.5亿元/年。同时，该酶制剂还是良好的饲料添加用酶。

目前β-1,3-1,4-葡聚糖酶制剂大多使用真菌发酵生产，细菌来源的较少。筛选能够产生大量β-1,3-1,4-葡聚糖酶的细菌也具有积极意义。但野生菌产量较多，是因为其胞外蛋白酶系较为丰富，抑制了β-1,3-1,4-葡聚糖酶的合成，将此酶基因单独表达，并进行基因以及酶学性质方面的研究，为β-1,3-1,4-葡聚糖酶的规模化生产及推广具有深远的技术指导意义。

发明内容

本发明要解决的一技术问题是提供一种水解大麦β-葡聚糖的β-1,3-1,4-葡聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种编码的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

此外，本发明还提供了一种生产的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的方法，具体包括如下步骤：首先采用化学全合成或PCR方法获得SEQ ID NO.2所示核苷酸序列；克隆获得的核苷酸序列到pET28a(+)表达载体；然后将获得的表达载体转化E.coli BL21获得表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的基因工程菌；最后通过优化发酵工艺，将获得的基因工程菌在LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基37℃培养2h后用4mg/L IPTG及终浓为10mmol/L乳糖诱导，降温至25℃培养，24h时离心收集上清酶液。

包含本发明β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的表达载体属于本发明要求保护的范围。

包含本发明提供的表达载体的细胞系或基因工程菌也为本发明要求保护的范围。

β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活的测定采用改良AZO方法，测定原理及步骤为。

带蓝色基团的大麦β-葡聚糖，在β-葡聚糖酶的作用下，由于β-葡聚糖大分子中的β-1,3-1,4键的断裂，将蓝色基团释放到反应体系中，加入特定的沉淀液后，经过离心，清液在590nm处具有吸光值，且吸光值的大小直接与酶活力的高低成正比。