[发明专利]RGA法检测促胰岛素分泌肽融合蛋白生物学活性

说明书

技术领域：

本发明涉及生物药物活性检测领域，针对促胰岛素分泌肽融合蛋白(Byetalog)的生物学活性测定建立了一种更加快速、准确的报告基因定量方法(report gene assay，RGA)。

背景技术：

促胰岛素分泌肽(Exendin-4)的研究应用成为近年来糖尿病治疗领域的研究热点之-。Exendin-4可以有效解决当前2型糖尿病治疗的多重挑战：有效降低血糖同时不增加低血糖风险；改善β细胞功能；减轻体重；降低心血管风险。促胰岛素分泌肽融合蛋白(Exendin-4-HSA，Byetalog)是中国研发的治疗2型糖尿病的长效蛋白质药物，目前常用的活性测定方法为cAMP酶标法，需要繁琐的ELISA检测步骤和昂贵的试剂盒。Exendin-4是胰升糖素样肽-1(GLP-1)类似物，其生物学效应的发挥是通过与GLP-1R结合，激活腺苷酸环化酶(AC)，产生cAMP，进而激活cAMP依赖的转录因子，后者与cAMP反应元件(cAMP response element，CRE)结合激活下游基因的转录。报告基因法(report gene assay，RGA)是一种快速、简便的检测方法，利用药物作用后报告基因表达的变化来反映药物的活性。结合Exendin-4的具体作用机制和RGA的优势，我们将CRE报告基因与GLP-1R共转染CHO-K1细胞，建立了一种更加简便，低成本的检测方法。

发明内容：

1.发明目的：

建立一种更加快速，简便，准确客观的Byetalog活性测定报告基因法，促进该产品的研究开发，质量控制以及临床应用。

2.技术方案：

本发明通过将GLP-1R载体和cAMP反应元件(cAMP response element，CRE)报告基因载体共转染CHO-K1细胞，并加压筛选分离培养出单克隆细胞株，再建立相应的检测方法来对Byetalog活性进行定量。其技术流程为：CHOGLP1R/CRE细胞株的建立(GLP1R和报告基因载体单克隆细胞株)→RGA测定方法建立及方法学验证。

3.有益效果：

该检测方法的建立有利于Byetalog药品的研究开发，质量控制和临床应用，具有较高的应用价值。

通过与现有的方法比较，有如下优点：

(1)成本较低，不需要昂贵试剂盒；

(2)操作简单，不需要繁琐的ELISA步骤；

(3)周期短，可以在24小时内完成全部实验；

(4)结果客观可靠，准确度高，变异小。

附图说明：

图1-1 western blot检测GLP-1R表达

图1-2 CHO-K1瞬时转染GLP-1R/CRE前后对Byetalog的反应性比较

图2-1单克隆细胞株的反应性比较

图3-1 不同细胞密度的比较

图3-2 Byetalog作用时间不同的实验结果

图3-3 预稀释浓度及检测范围

图4-1 初步方法学验证

具体实施方式：

1.材料与方法：

1.1研究对象：促胰岛素分泌肽融合蛋白

1.2GLP-1R质粒：购买于傲锐东源基因有限公司。

pGL4.26载体：购买于promega。

CHO-K1细胞：购买于ATCC。

Byetalog标准品与样品：中国食品与药品研究检定院重组技术产品室留存。

1.3试剂：

生长培养基：F12K+10％胎牛血清(GIBCO，#10099)+1％双抗(GIBCO，#15240)

平板培养基：Opti-MEM(GIBCO，#31985)

MegaTran 1.0转染试剂：origene，TT200003

G418：CalBiochem，#345810

潮霉素：Cellgro，30-240-CR

选择培养基：生长培养基+200ug/ml G418+300ug/ml潮霉素

Glo lysis：promega，E2661

荧光素酶底物：promega，E2650

GLP-1R抗体：Abcam，ab39072

化学发光底物：pierce，P1010

TMB：Amersco，J644

1.4仪器：

酶标仪，SpectraMax M5

化学发光成像仪，LAS-3000