[发明专利]一种鸡坏死性肠炎（C型）灭活疫苗的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鸡坏死性肠炎（C型）灭活疫苗的生产方法。属于兽用生物制品制造领域。

背景技术

鸡坏死性肠炎又称为梭状芽孢杆菌肠炎（Clostridial enteritis），菌群失衡症（dysbacteriosis）或小肠细菌生长过度症（SIBO）。是由产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）A型或C型引起的一种疾病，A型产气荚膜梭菌产生α毒素，C型产生α和β毒素，这两种毒素是引起坏死性肠炎的主要毒素。病死禽以肝肿大、肠道出血和肠黏膜有麸皮样坏死灶为特征，正常鸡群的发病率为1.3%～37.3%，无特定病原鸡群的发病率可高达62%（王泽华，李灿恒.鸡坏死性肠炎的诊断与防治，中国禽业导刊，2002，19（14）：35-36）。

目前国内尚没有针对鸡坏死性肠炎的疫苗，治疗该病主要采用抗生素。国内其他梭菌类疫苗生产采用的是肉肝胃酶消化汤培养基，该培养基其主要成分牛肉和肝等，受动物品种、年龄、新鲜及消化程度的影响较大，造成培养基质量不稳定、批次间离散度大且制作过程繁琐，进而影响疫苗的质量，特别是疫苗的均一性。大规模发酵用合成培养基按照产气荚膜梭菌营养代谢特点设计，添加了促进菌体增殖、提高保护性抗原含量的生长因子，具有产毒量高、质量稳定、操作简便等优点。合成培养基是细菌疫苗质量好坏的关键因素，有鉴于此，本发明旨在设计一种适合C型产气荚膜梭菌CVCC60102株生长、产毒量高、成分相对确定、易于在线检测、监控和及时调整的合成培养基，制备C型产气荚膜梭菌灭活疫苗。

发明内容

将C型产气荚膜梭菌CVCC 60102株种子液按培养基总量的体积比1%～2%接种于以胰酪蛋白胨和酵母浸出粉为主要原材料的液体合成培养基中，37℃厌氧培养/或静置培养培养18小时，培养结束后经3000r/min离心30min，去除菌体，分别用8Ku截留分子量的超滤浓缩系统进行超滤浓缩，经0.6%的甲醛溶液灭活脱毒完全后，加入终浓度20%的氢氧化铝胶配制成疫苗。

本发明详细描述

1.疫苗生产用菌种

（1）来源产气荚膜梭菌CVCC60102株菌种，原C59-2，5-2，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。该菌是1953年分离自内蒙古自治区呼纳盟新巴右旗的猝狙羊心血，强毒株。

（2）菌种特性

毒力：肉肝胃酶消化汤培养物上清静脉注射，0.001ml致死小白鼠；0.05ml致死家兔,0.5ml可致死绵羊。

免疫原性：1.0ml铝胶苗免疫家兔可产生75%～100%保护。

2培养基采用本发明设计的合成培养基

（1）配方如下：

蛋白胨3g，酵母粉0.3g，氯化钠0.25g，磷酸氢二钾0.45g，葡萄糖0.5g，亚硫酸钠0.2g，半胱氨酸盐酸盐0.05g，糊精1g，Vc0.001g，去离子水加至100ml。

（2）合成培养基配制方法

按配方称取各成分溶于去注射用水中，用2mol/L的氢氧化钠调节pH值至8.0～8.4。116℃高压灭菌30min。

（3）合成培养基检验

1）性状溶液澄清透明、呈棕色。

2）无菌检验按中华人民共和国兽药典（中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○一○版三部.中国农业出版社，2011,以下称《中国兽药典》）规定的方法进行，应无菌生长。

3）pH值应为8.0～8.4。

4）生长试验

⑴种子液制备

将C型产气荚膜梭菌CVCC 60102株（中国兽医药品监察所提供）冻干菌种用1ml普通肉汤（中国兽医药品监察所提供）稀释后，接种于10ml肉肝胃酶消化汤中，置37℃培养18～24小时，同时分别接种普通肉汤、普通琼脂斜面、厌气肉肝汤和石蕊牛奶各2管，每管0.2ml，培养48小时，纯粹检验合格后作为一级种子。在2～8℃保存，使用期不得超过15日。取一级种子0.1ml接种10ml肉肝胃酶消化汤，37℃培养18小时，纯粹检查合格后作为二级种子（中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二○○○年版.化学工业出版社，2001，以下称《规程》）。

⑵菌液培养及判定

将种子液按培养基总量体积比的1%接种到装有200ml液体培养基的500ml三角瓶内，37℃静置培养18小时，同时设1个不接种阴性对照。分别取样3000r/min离心30min，取上清按现行《规程》进行毒力测定（见附注）。毒力应达到500MLD/ml，且阴性对照应无菌生长。