[发明专利]一种无选择标记载体及应用该载体培育高含类黄酮和咖啡酰奎尼酸的马铃薯的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，提供了一种以马铃薯块茎特异表达基因patatin的启动子、拟南芥AtMYB12基因和Cre/lox位点特异性重组系统构建pX6-patatin::AtMYB12无选择标记载体，同时利用一个相对于前人更简单有效的农杆菌转化法将目的基因转入马铃薯品种Desiree中，获得无选择标记的高含类黄酮和咖啡酰奎尼酸的马铃薯。 

背景技术

拟南芥R2R3-MYB类转录因子AtMYB12为类黄酮生物合成的特异激活子，在拟南芥中可以增加类黄酮含量的积累。Luo等将该基因转化到番茄中，发现芦丁和山奈酚-芸香糖苷含量比对照增加了65倍，总的黄酮醇，积累量达到了72mg/g DW。 

类黄酮(Flavonoid)又称黄酮类化合物，是一类具有“黄烷核”基本骨架的低分子量多酚类物质的总称。黄烷核由2个芳香环(A环和B环)通过1个中央三碳链(可能形成杂环C环)连接而成。根据B环的连接位置、中央三碳链的氧化程度以及中央三碳链是否构成环状等特点，可以把黄酮类化合物分为6大类：黄酮类、黄酮醇类、黄酮酮类、儿茶精类、异黄酮类、花青素类。类黄酮广泛存在于各种植物中，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗骨质疏松、抗肿瘤等功能。在农业、医药、饲料、化工等领域有着重要的应用价值。 

除了植物中普遍存在的花色苷外，黄烷酮，黄酮醇，黄酮等其他类黄酮物质在马铃薯块茎，花，叶，种子中也均被发现，但是含量极低。Lewis等运用HPLC法对26种有色马铃薯栽培品种的块茎，花，叶中主要的酚类化合物的含量进行了测定。花中类黄酮含量最高，达到1000-3000μg/g，其次为叶，为500-2000μg/g，块茎中最低，为200-400μg/g，且块茎肉中仅有0-30μg/g。块茎中的类黄酮种类主要为黄烷酮、柚皮素、圣草酚、儿茶酸和表儿茶酸。最常见的槲皮素、芦丁、山奈酚和山奈酚芸香苷等黄酮醇在块茎中痕量存在。 

绿原酸(Chlorogenic acid)，是由咖啡酸(Caffeic acid)与奎尼酸(Quinic acid，1-羟基六氢没食子酸)生成的缩酚酸，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。根据咖啡酰在奎尼酸上的结合部位和数目不同，从理论上讲，单咖啡酰奎尼酸和二咖啡酰奎尼酸所组成的绿原酸异构体共有10种，分别为：1-咖啡酰奎尼酸、3-咖啡酰奎尼酸、4-咖啡酰奎尼酸、5-咖啡酰奎尼酸、1，3-二咖啡酰奎尼酸、1，5-二咖啡酰奎尼酸、1，6-二咖啡酰奎尼酸、3，4-二咖啡酰奎尼酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸、4，5-二咖啡酰奎尼酸。到目前为止，从植物中发现的绿原酸异构体有如下：绿原酸(3-咖啡酰奎尼酸)、隐绿原酸(Band510(4-咖啡酰奎尼酸)、新绿原酸(5-咖啡酰奎尼酸)、异绿原酸A(4，5-二咖啡酰奎尼酸)、异绿原酸B(3，4-二咖啡酰奎尼酸)、异绿原酸C(3，5-二咖啡酰奎尼酸)、莱蓟素(1，3-二咖啡酰奎尼酸)。本研究中涉及的5-咖啡酰奎尼酸均称为绿原酸。 

绿原酸的生物活性：绿原酸被认为是众多药材和中成药抗菌解毒、消炎利胆的主要有效成分，通常被作为定性甚至定量的指标。据报道，绿原酸的主要生物活性有(1)对透明质酸酶及葡萄糖-6-磷酸酶的抑制作用；(2)对自由基的清除及抗脂质过氧化作用；(3)抗诱变作用；(4)保肝利胆作用；(5)抗菌、抗病毒及解痉等作用。 

马铃薯是重要的粮食作物之一，属于茄科，同源四倍体，应用杂交育种的方法改良品种比较困难，同时马铃薯块茎中多酚类化合物含量非常低。在培育马铃薯品种的研究中，营养品质是马铃薯品种改良的一个主要目标，利用基因工程技术有较大的优势，因其可以通过块茎无性繁殖，将转基因特性传递给后代而无需经花培纯化或多代选育。随着分子生物学研究的不断深入，马铃薯遗传转化体系也日趋成熟，但仍存在基因性限制、转化率较低的问题。