[发明专利]整合O型口蹄疫病毒shRNA转基因克隆猪的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种整合O型口蹄疫病毒shRNA转基因克隆猪的制备方法，具体是通过shRNA的设计和制备、细胞的转染和攻毒、RT-PCR、实时定量PCR等过程筛选出高效抑制O型口蹄疫病毒的小干扰片段，并构建抗口蹄疫病毒shRNA表达载体，将优秀干扰片段转染至猪胎儿成纤维细胞，利用体细胞核移植和胚胎移植技术获得抗O型口蹄疫病毒转基因克隆猪，属于动物转基因技术领域。 

背景技术

口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）是由小RNA病毒科的口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起的严重危害偶蹄动物的高度接触性、急性、发热性传染病，发病率几乎100%，动物发病后，主要症状为口腔黏膜、蹄、乳头及乳房皮肤发生水疤。该病流行于欧洲、非洲、拉丁美洲的近60个国家，某个国家一旦爆发口蹄疫，老百姓要么拒买肉类食品，要么哄抢食品，发病国与世界其他国家的肉食品贸易将停止，因此往往造成社会动荡或政治纠葛。同时，该病给经济造成巨大的损失，2001年英国暴发口蹄疫，为处理本次疫病，花费近50亿美元。口蹄疫对全球的社会稳定及经济发展影响巨大，因此，世界动物卫生组织(OIE)把该病定为A类家畜传染病之首，中华人民共和国农业部也将其定为一类动物疫病的第一位。口蹄疫病毒有A 、O 、C 、Asia1 和南非1 、2 、3 型7个血清型，不同亚型有70多个。对口蹄疫的防治，发达国家大多采取扑杀销毁的措施，发展中国家主要依靠疫苗免疫接种，但此种方法存在疫苗毒力反强、活病毒逃逸生产车间、灭活不彻底及疫苗研制滞后于病毒的变异等弊端，从而限制了此类疫苗的广泛应用。同时，由于FMDV是一种高度变异性的RNA病毒血清型，而各型间不存在交叉保护作用，通过免疫接种来预防和控制口蹄疫的流行变得越来越困难。 

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是最早发现于植物细胞中的一种转录后的基因沉默技术，它是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，也即通过对目的基因转录后产生的mRNA的降解而使目的基因不能表达，即所谓的基因沉默，其原理是通过导入或细胞内产生与靶mRNA序列特异互补的小分子双链RNA,这种RNA称为小分子干扰RNA（即siRNA）。siRNA产生后，通过siRNA中的一条链与靶mRNA序列互补配对，再在一系列酶的作用下将靶mRNA降解，从而使靶mRNA不能翻译、表达，使其表型沉默。RNAi发现后，人们利用它来分析基因功能、设计药物，因效果理想得到广泛的认可，同时它已经被用于代谢病、肿瘤、感染性疾病等各种病症的预防和治疗。丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、人的免疫缺陷病毒流感A病毒、人的乳头瘤病毒以及冠状病毒已被人们通过RNAi得到抑制或消除，研究者表明RNAi是当前抗病毒感染比较有效的方法之一，对防治严重的动物传染病意义十分重大。 

将体外重组基因导入早期胚胎或受精卵的基因工程技术称为转基因动物技术，被整合的外源结构基因称为转基因，该技术被公认是继连锁分析、体细胞遗传、基因克隆之后的第四代技术。转基因动物（Transgenic animals）是指将外源基因通过基因工程方法导入动物基因组内或者是通过人为的方法改变动物基因组序列的表达方式，这种改变后的基因组能够稳定地遗传其后代的遗传工程动物。Gordon等人在1980年首先育成转基因小鼠，此小鼠体内带有人的生长激素基因，它的生长速度比实验对照组小鼠快2~4倍，人们称其为转基因“硕鼠”，自此，转基因动物技术开始受到生命科学界的广泛关注。转基因动物技术是综合活体动物水平、细胞水平、分子水平的一种技术体系，也是实验动物学、发育生物学、生殖生物学、遗传学、细胞生物学、分子生物学等学科的技术和理论知识的综合应用。转基因动物研究经历了几十年探索及发展历程，得到了不断的完善，在生命科学中的许多领域得到广泛应用，目前转基因动物技术已经在病毒性疾病研究、心血管疾病研究、免疫学研究、肿瘤学研究、遗传病研究、基因治疗、器官移植、建立新药筛选及检测和治疗人类疾病的动物模型中得到广泛应用。