[发明专利]全氟化合物降解菌基因、其合成方法及其应用

权利要求书

1.一种全氟化合物降解菌基因，其特征在于该降解菌基因的序列为SEQ ID NO：1所示的碱基序列。

2.一种合成根据权利要求1所述的全氟化合物降解菌基因，其特征在于该方法的具体步骤为：

配制质量分数为1%～50%的土壤溶液，充分静置后，取上清液作为初始菌种液；添加全氟有机化合物作为菌株生长的诱变因子，使其初始浓度为100毫克每升至～1×10⁵克每升，在37摄氏度和100～200转每分钟转速下培养至菌液浑浊；以10%转接量接入新鲜菌液，并梯度增加全氟化合物的浓度，至全氟化合物的终浓度达到初始浓度的1～10倍，在同样条件下培养至菌液浑浊；

将步骤a所得菌液采用稀释涂布和反复划线分离方法，获得能够正常生长的微生物；具体稀释步骤如下：

b-1.从步骤a所得的浑浊菌液取出50～100微升，加入到含有3～5毫升无菌水内；然后，振荡小试管使菌液与无菌水混合均匀，得混合液，编号标记；

b-2.将步骤b-1所得混合液中再取出50～100微升液体，加入到第二支含有3至5毫升无菌水的10毫升规格的小试管内，振荡混合均匀；重复操作10～15次；并按顺序依次编号；

b-3.从每个编号中取出混合液均匀涂抹在固体培养皿中，并编好相应号码，放入37摄氏度的生化培养箱中培养至出现菌落；

采用基因组试剂盒对步骤b所得微生物进行基因组DNA快速提取，即得到全氟化合物降解菌基因。

3.根据权利要求2所述的全氟化合物降解菌基因，其特征在于上述步骤c的具体方法为：

c-1.将上述步骤b所得微生物配制成菌体密度OD₆₀₀为0.8～1.2浓度的菌液，培养7～12小时的菌液作为被测试对象，将没有加菌的培养液作为测吸光度时的空白对照；

c-2.在10000rpm转速下离心分离30s；弃上清液，再加入Digestion消化液，并吹打均匀；再加入10mg/mL蛋白酶K，混均匀后在56℃水浴锅内消化30~60min至完全透明；消化完全后，再加入 RNase酶，室温消化5min；加入 BD Buffer混均，在70℃温度下消化10min；加入无水乙醇混均；将所有液体移入回收柱内，在转速为12000rpm的离心机内离心3min；舍弃上清液，加入PW Solution，在转速为10000rpm下离心1min，离心后弃上清液；在转速为10000rpm下离心2min；将回收柱移入离心管内，在吸附膜正中央加入经65℃~80℃下预热后的Elution Buffer，在60℃水浴锅内水浴5min；水浴结束后，在转速为10000rpm下离心1min即得到基因组提取液。

4.一种降解全氟化合物的方法，采用根据权利要求1所述的降解菌基因，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.将降解菌加入到液体培养基中，降解菌的体积为液体培养基的5%～20%；

b.再在步骤a所得液体培养基中加入浓度为100mg/L～1×10⁵g/L每升的全氟有机化合物；

c.在35～38摄氏度，转速为100～200转每分钟的振荡培养箱中培养至菌液完全浑浊；

d.从步骤c所得液体培养基中取出10～50毫升，离心后取上清液体，然后，从上清液体里取7～10毫升用作离子色谱测定分析液；

e.剩下的液体培养基进行萃取，分别收集有机层和水层，再采用旋转蒸发仪对有机相和水相进行旋干；

f.水相旋干瓶内加入氘代乙醇或重水进行H¹ NMR和¹⁹F NMR检测分析；

g.有机旋干瓶内加入等体积的三氟乙酸乙酯标准溶液作为内标和DMSO-d₆，进行H¹ NMR和¹⁹F NMR检测分析；根据¹⁹F NMR测试结果中氟信号强度比，计算出全氟化合物大致的降解率。