[发明专利]布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株的构建及毒力和免疫原性的测定

说明书

技术领域

本发明涉及布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株的构建及毒力和免疫原性的测定，属于微生物细菌基因工程技术领域。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis，简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的以感染家畜为主的人兽共患传染病。布鲁氏菌具有宿主广泛、传染性强以及感染后根治困难等特点，对畜牧业和人类健康均构成严重威胁。

疫苗免疫是预防和控制布鲁氏菌病的主要措施。目前，用于牛布鲁氏菌病免疫的A19苗有较好的免疫力，该疫苗在我国使用至今已有60余年，为有效地控制布病提供了重要保障，但同时也存在一定的缺陷。即现用的A19疫苗缺乏鉴别诊断标记，疫苗接种动物与自然患病动物无法甄别，造成布鲁氏菌无法在畜群中根除，严重地影响了布鲁氏菌病的诊断、检疫。

本发明借助于现代生物学和分子细菌学技术改造现有A19疫苗菌株，使其成为分子标记疫苗。该疫苗免疫动物在获得免疫保护作用的同时又能将感染患病动物进行区别，有利于临床患病动物的检疫淘汰，保护人们的健康和安全。另外，VirB12基因是布鲁氏菌四型分泌系统中的一个毒力因子，敲除VirB12基因的A19疫苗株的毒力有所减弱，提高了布鲁氏菌病疫苗的安全性，但其仍然保持原有疫苗的免疫学原性和生物学特性。A19疫苗株生产与应用都有较长的历史，因此，敲除VirB12基因的A19分子标记株提升了原有的布鲁氏菌病A19疫苗功能，作为一种新型疫苗投放市场周期短、风险小。敲除的VirB12基因为建立区分疫苗免疫和自然感染动物的鉴别方法提供了分子标记。为将来应用免疫学方法甄别免疫动物与自然感染动物抗体提供了检测基础，因此，A19分子标记株可以作为疫苗用于牛布鲁氏菌病的预防。

发明内容

本发明的目的在于提供一种布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株的构建及毒力和免疫原性的测定，用PCR方法区分分子标记疫苗株和野毒株。本发明所述的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株的构建，是应用同源重组技术敲除了布鲁氏菌病A19疫苗株中毒力因子VirB12基因，得到A19-ΔVirB12分子标记疫苗株。以小鼠实验测定的A19的分子标记疫苗株的毒力、安全性、免疫原性。建立了区分该分子标记疫苗株与布鲁氏菌野毒株的PCR方法。

本发明所述的一种布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株的构建，其特征在于按下列步骤进行：

a、为敲除布鲁氏菌A19菌株的VirB12基因，从布鲁氏菌A19疫苗株基因组中分别扩增出VirB12基因上游同源臂片段和下游同源臂片段；

b、再将扩增出VirB12基因上游同源臂片段和下游同源臂片段经中间载体pGEM-T将其克隆至自杀性质粒pBK-CMV-S载体上，从而构建敲除VirB12基因的重组自杀质粒pBCSV12；

c、将重组自杀质粒pBCSV12电击到A19感受态细胞里，运用同源重组技术原理筛选同源重组双交换子，得到敲除VirB12基因的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株。

所述的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株的构建中，是将流产布鲁氏菌A19菌株中的四型分泌系统的一个毒力因子VirB12基因敲除得到的菌株，即A19-ΔVirB12株。

所述的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株的构建中，毒力因子VirB12基因如序列表的序列1所示。

所述的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株的构建中，毒力因子VirB12基因的编码序列如序列表的序列2所示。

所述的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株毒力和免疫原性的测定，通过构建的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株应用常规的PCR方法鉴别区分布鲁氏菌野毒株和分子标记疫苗株。

所述的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株毒力和免疫原性的测定中，通过构建的布鲁氏菌病A19分子标记疫苗株按常规方法进行毒力和免疫原性的测定，其中A19分子标记疫苗株毒力弱于亲本A19株，以BALB/C鼠为动物模型，A19分子标记疫苗株具有好的免疫原性。

本发明所述敲除牛布鲁氏菌病A19疫苗株的VirB12基因的构建，包括以下步骤：

以牛布鲁氏菌病A19疫苗株为起始材料，用PCR的方法从A19的染色体中扩增出VirB12基因上下同源臂片段，分别并把它克隆至中间载体pGEM-T上；自杀性质粒pBK-CMV载体上含有果聚糖蔗糖转移酶基因(sacB基因)，即自杀性pBCS质粒，该质粒由新疆畜牧科学院兽医研究所保存。通过分子克隆分别将VirB12基因上游同源臂片段和下同源臂片段与自杀性质粒pBCS连接，得到重组自杀性质粒pBCSV12；