[发明专利]用于检测ERCC1mRNA的核酸检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种基因检测试剂盒，采用探针实时荧光定量PCR技术，能够对人类非小细胞肺癌（NSCLC）中的ERCC1表达水平进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度。

背景技术

肺癌是全球发病率和病死率最高的肿瘤之一，其中约80%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。非小细胞肺癌的治疗要根据肺癌的临床分期来进行。对Ⅰ、Ⅱ、ⅢA期主要以手术切除为主，淋巴转移显著者，于手术前可辅以化疗或放疗。但是由于其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚；现今又缺乏有效的早期诊断手段，初诊时约75%的患者失去了第一次手术机会，即：确诊时多已不能进行手术治疗，仅能通过化疗或放疗缓解。而晚期NSCLC目前仍以联合化疗为主，但5年生存率不到15%。因而早发现、早诊断是争取良好预后的关键所在。

ERCCl基因位于染色体19q13．2-13．3编码一种含有297个氨基酸的蛋白质，参与DNA链的切割和损伤修复，其表达产物与DNA修复酶缺乏互补基因F(XPF)形成紧密的异二聚体(ERCC1一XPF)，具有损伤识别和切除5’端的双重作用，在核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，NER)中起到限速或调节的重要作用。其活性的高低可反映整个NER修复活性的水平。在一些肿瘤细胞中，ERCC1，XPB，XPD等核苷酸切除修复因子mRNA表达显著降低，提示核苷酸剪切修复能力的降低，导致细胞发生癌变的几率增加。有报道I一Ⅲ期NSCLC患者手术标本ERCC1的表达水平与生存期存在一定的关系：①I期NSCLC患者存在ERCC1高表达，是术后预后良好的独立指标。②ERCC1表达对I期和Ⅱ一Ⅲ期NSCLC术后生存具有双重效应：ERCC1高表达减少了术后肿瘤复发的危险但同时对DDP耐药，I期NSCLC术后ERCC1高表达发挥更多的是其保护的一面，而Ⅱ一Ⅲ期以铂类耐药或抵抗为主。因而，ERCC1表达水平对于后期的用药有着极其重要的指导作用。

在实际应用中，用于检测ERCC1表达的方法主要为免疫组化，尽管该法原理简单，但是试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，且试验结果需要经验丰富的专家来判读，判读结果存在较大的主观性，一定程度上限制了该法的应用。正是因为免疫组化法存在这些问题，才促使我们探索新的方法来检测ERCC1表达水平。

实时荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异性,而且能对PCR进行实时在线检测,反应ERCC1在组织中的初始含量，试验节约了大量的检测时间,还避免了遗留污染的发生。常见的方法有SYBR GreenI染料法,双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于ERCC1基因检测。

发明内容

鉴于现有技术中检测ERCC1的不足，本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，用荧光定量PCR技术检测ERCC1基因。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，开发了一种用于检测ERCC1 mRNA的核酸检测试剂盒。

用于检测ERCC1mRNA的核酸检测试剂盒，包括红细胞裂解液、RNA提取液、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；其特征在于：

检测体系PCR反应液包括PCR缓冲液、d NTP、Mg²⁺、检测用上下游引物ERCC1-F/ERCC1-R和探针ERCC1-Probe、参照用上下游引物Actin-F/Actin-R探针Actin-Probe；其中，

ERCC1-F：GGGAATTTGGCGACGTAATTC

ERCC1-R：GCGGAGGCTGAGGAACAG

ERCC1-Probe：FAM-TATGTGCTGGGCCAGAGCACCTGTG-TAMRA

Actin-F：TGAGCGAGGCTACAGCTT

Actin-R：TCCTTGATGTCGCGCACGATTT

Actin-Probe：FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。