[发明专利]一种白藜芦醇生物转化菌种筛选、菌种鉴定及利用该菌种进行白藜芦醇生物转化的方法

权利要求书

1.一种白藜芦醇生物转化菌种的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取打碎的虎杖置于烧杯中，向其中加入去离子水，料液重量体积比为1g/2ml，静置24h，得虎杖浸出液；

2)取富集培养基分装至若干个三角烧瓶中，分别标号并加入虎杖浸出液20μL，封口于28℃、避光、200r/min下震荡培养4d后，采用TLC方法检测，得出转化效率最高的培养液；

3)将转化效率最高的培养液于筛选培养基上做梯度稀释涂板，于28℃下培养，然后观察是否有能形成水解圈的菌种长出，挑出单菌落重复操作，48h后观察水解圈形成情况；

4)取水解圈培养基，用甲醇提取，水解圈培养基/甲醇＝1g/10ml，稀释后进行TLC分析，并对白藜芦醇生成的提取物进行HPLC分析，观察白藜芦醇生成情况，根据得到的水解圈及白藜芦醇生成情况得到具有高转化能力的菌种S-4。

2.根据权利要求1所述的白藜芦醇生物转化菌种的筛选方法，其特征在于，步骤2)中，所述富集培养基的制备方法是，称取硝酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.1g，MgSO₄·7H₂O0.05g，氯化钟0.05g，硫酸亚铁0.001g于容量瓶，蒸馏水定容至100mL，即得基础培养基；使用前称无菌白藜芦醇苷100mg加入已灭菌基础培养基中，制得富集培养基。

3.根据权利要求1所述的白藜芦醇生物转化菌种的筛选方法，其特征在于，步骤3)中，所述筛选培养基的制备方法是，称取硝酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.1g，MgSO₄·7H₂O0.05g，氯化钾0.05g，硫酸亚铁0.001g于容量瓶，蒸馏水定容至100mL，即得基础培养基；在基础培养基中添加基础培养基重量1.5％的琼脂固定，使用前加热溶解，冷却至50℃时称取无菌白藜芦醇苷100mg加入其中，充分混匀，即得筛选培养基。

4.根据权利要求2或3所述的白藜芦醇生物转化菌种的筛选方法，其特征在于，所述无菌白藜芦醇苷是在无菌工作环境下将白藜芦醇苷加入无菌乙醇中，自然挥干所得，白藜芦醇苷∶无菌乙醇＝0.5g∶10ml。

5.一种白藜芦醇生物转化菌种的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)菌种的形态学观察，将PDA固体培养，察氏固体培养基倒平板，冷凝后用接种钩挑取菌丝少许，点接于平板，30℃培养箱中倒置培养48h以上，观察菌落形成的过程和形态；

2)用水浸片法制片，在干净的载波片中央滴加一滴乳酸石炭酸蓝棉液，用解剖针从菌落边缘划取菌丝体一小块，放入乳酸石炭酸蓝棉液中，盖上盖玻片，在显微镜下观察菌株的菌丝有无横隔、足细胞，观察孢子的形状大小和着生方式及其孢子梗；

3)参照真菌提取试剂盒附带提取方法操作提取菌种基因组DNA，配制好PCR扩增体系，然后在PCR仪上进行扩增，完成后经1％琼脂糖凝胶电泳后，观察与拍摄结果；

4)将得到的菌株ITS序列用GenBank中的Blast程序与数据库中的其它菌株进行比较分析，得出相似性。

6.一种利用如权利要求所述的方法筛选的菌种进行白藜芦醇生物转化的方法，包括以下步骤：

1)取打碎的虎杖置于烧杯中，向其中加入去离子，料液重量体积比为1g/2ml，静置16-24h得虎杖浸出液；

2)另取PDA培养基装容器中，加入虎杖浸出液，封口，得虎杖苷溶液；

3)将菌液加入虎杖苷溶液中，菌液和虎杖苷溶液的体积比为0.5∶1，封口于28℃、避光、200r/min下震荡培养4d。